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棉花纤维的伸长决定着纤维的质量和产量。对棉花伸长相关基因的发掘和及其分子机理的研究具有重要意义。虽然利用表达谱和其他功能基因组手段找到一些对棉花纤维发育相关的关键基因,但是这些基因在纤维发育中的作用机理还很不清楚。在本实验室涂礼莉老师构建的海岛棉全生育期纤维cDNA文库中,我们找到两个在纤维伸长时期高丰度表达的钙离子结合蛋白基因GhCaM7(陆地棉钙调素7)和GhAnn2(陆地棉膜联蛋白2),并通过转基因、细胞生物学、药理学和电生理学等手段对这两个基因在纤维发育中的功能做了一定的阐述。具体结果如下：1、GhCaM7(TC232366)在发育中的纤维中高量表达,且其表达丰度在所有钙调素成员中最高。通过搜索DFCI棉花EST数据库中找到7个陆地棉钙调素家族成员基因。RT-PCR的结果显示有三个成员TC232366.TC244650和TC256165在纤维中有较高量的表达。进一步通过qRT-PCR发现TC232366(GhCaM7)在纤维中的表达丰度较另外两个钙调素更高。GhCaM7在纤维发育中的表达跟纤维顶端钙离子流入速度趋势一致,并且这个基因在无纤维突变体胚珠中表达较正常陆地棉品系低,这些结果说明,GhCaM7可能在纤维发育中起着重要作用。2. GhCaM7对早期纤维的发育有促进作用。将GhCaM7在35S启动子驱动下进行超量表达和RNA特异干涉。表型鉴定结果显示,超量表达GhCaM7能够促进纤维早期的伸长而不是后期,而抑制GhCaM7的表达会使纤维的突起延迟且纤维的伸长也会受到抑制。另外,体外胚珠培养实验结果也同样显示,胚珠在BT培养基上培养10天后,GhCaM7超量表达的纤维明显长于野生型,而干涉纤维明显短于野生型。用钙调素的拮抗剂TFP(三氟拉嗪)处理培养中的胚珠,纤维发育也明显受到抑制。这些结果都说明GhCaM7对早期纤维发育有促进作用。3、GhCaM7能通过调控ROS的产生来促进纤维早期发育。通过外源添加双氧水和钙饥饿诱导实验,发现一定量的活性氧在纤维伸长中都能起到正调控的作用。我们通过活性氧定性和双氧水定量实验检测了GhCaM7转基因材料纤维和胚珠中的ROS水平。结果发现,GhCaM7超表达促进了ROS的积累,而GhCaM7干涉材料中ROS水平明显比野生型低。同时利用胚珠培养体系对转基因和野生型胚珠进行了双氧水和DPI(活性氧抑制剂)的处理,结果也表明GhCaM7可能在ROS的上游行使功能。4、ROS对GhCaM7的表达也有调控作用。通过非损伤微测技术和胚珠培养实验发现双氧水能促进钙离子的内流和钙库钙离子的释放。qRT-PCR结果显示外源双氧水也能诱导GhCaM7的表达,这说明ROS可以引发钙离子的内流来增加细胞内钙离子浓度,这样就进一步激活GhCaM7的表达。另外,钙库钙离子释放通道抑制剂的处理实验也显示钙饥饿的条件下,ROS的水平受到诱导上升,从而促进内源钙库的钙离子的释放,进而上调GhCaM7的表达,进一步证明ROS可以调节GhCaM7的表达。5、GhCaM7在IAA诱导的纤维伸长中起着积极作用。qRT-PCR分析结果表明GhCaM7可以被IAA诱导表达。随后利用胚珠培养体系进一步考察GhCaM7和IAA的关系时发现,当BT培养基中不加IAA或加入NPA (IAA运输抑制剂)时,培养的转基因株系和野生型株系纤维长度没有显著差别。而当BT培养基中加入TFP之后,IAA促进纤维伸长的效果被明显削弱。由此看来,GhCaM7在IAA诱导的纤维伸长中起着积极的作用。而GhCaM7只有在IAA存在的条件下才能更好的在纤维发育中行使作用。6、GhCaM7与IAA协同调控ROS产生5μM IAA处理胚珠能显著促进纤维伸长,也能诱导ROS的产生。而ROS抑制剂能显著减弱IAA对纤维伸长的促进效果。这说明IAA可能在一定程度上通过ROS来影响纤维伸长。胚珠ROS荧光染色结果显示,TFP可以明显减弱IAA诱导的ROS的产生。同时在IAA存在条件下,GhCaM7水平越高ROS产生越多,而在IAA少量存在或没有的条件下,GhCaM7不能更好的促进ROS的产生。而减弱钙调素作用,IAA同样也不能很好的产生ROS。这说明GhCaM7和IAA协同调控ROS的产生。7、GhAnn2在发育中的纤维中高量表达,并在纤维伸长期有表达高峰。生物信息学分析发现GhAnn2可能来自D基因组。将D基因组所有的膜联蛋白基因找出来并对他们进行RT-PCR和qRT-PCR分析,结果发现有7个膜联蛋白基因家族成员在纤维中有表达,其中GhAnn2在纤维快速伸长期有表达高峰。8、GhAnn2下调表达抑制纤维伸长和细胞壁的合成对GhAnn2干涉株系进行纤维长度和细胞壁厚度的考查结果显示GhAnn2干涉株系各个发育时期纤维较野生型显著变短且成熟纤维细胞壁显著变薄。qRT-PCR分析表明一些纤维伸长和次生壁合成相关基因在干涉纤维中表达下调。这说明GhAnn2是纤维正常发育所必需的。9、GhAnn2干涉纤维顶端钙离子流入减弱非损伤微测技术测定纤维顶端钙离子流发现,GhAnn2被干涉后,纤维顶端的钙离子流呈外流状态,而野生型纤维顶端钙离子呈正常的内流状态。这说明GhAnn2干涉后纤维顶端的钙离子内流减弱。另外用钙离子通道抑制剂La3+处理离体培养的胚珠发现GhAnn2干涉的纤维对La3+更加敏感。由此推测,GhAnn2的表达下调使得纤维顶端钙离子内流减弱导致细胞内钙离子浓度变小,从而对钙离子通道抑制剂更加敏感。10.GhAnn2的抑制表达扰乱纤维细胞中钙离子信号的传递由于GhAnn2能够调节纤维细胞顶端钙离子的流入,所以有可能对纤维细胞钙离子信号也产生影响。在GhAnn2RNAi纤维中对钙离子信号受体进行表达量检测发现,有2个CaMs,4个CMLs,4个CCaMKs和2个CBLs在Gh.Ann2的RNAi株系纤维中表达量降低。这说明下调GhAnn2的表达确实扰乱了纤维中钙离子信号。