生物素(vitaminH)是一种含硫维生素，是动物机体维持正常生理机能所必需的B族维生素之一，随着生物素缺乏症在多种养殖动物中的出现，人们已经对生物素的营养生理功能有了全新的认识，并使其成为最受重视的水溶性维生素之一。生物素在畜牧业、分子生物学、生物发酵及医药行业等领域应用广泛。生物素不能直接从自然界获得，而我国所用的生物素均从日本、美国等国家进口，且价格昂贵，因此，进行生物素合成的研究是非常必要的。目前，利用基因工程技术生产生物素是国际上高技术竞争的又一热点。 枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，细胞壁不含内毒素，能分泌大量蛋白到体外，为一些重要工业酶制剂的生产菌种。而影响克隆基因表达效率的因素有2个：第一是启动子的强度；第二是基因的拷贝数，但由于其在枯草杆菌中存在分离复制的不稳定及外源基因的克隆表达效率低的现象，将外源目的基因整合到染色体上复制表达是解决染色体外复制质粒在宿主中遗传不稳定现象的有效策略。因此本研究以枯草芽孢杆菌1A747菌株为研究材料，通过同源重组，将强的启动子pglv以及Cm基因整合到枯草杆菌染色体上，增加生物素操纵元基因的拷贝数，对其进行功能表达及检测。 设计引物以PCR方式扩枯草杆菌生物素操纵元基因bioWAFDB，得到整合载体YG50，根据这五个基因同源于与枯草杆菌1A747，通过单交叉整合方式将质粒YG50滚环式全部带入1A747染色体基因组，得到单交叉整合菌BI1。分别用五对引物，即intedia-1，intedia-2，bioW-bioB，bioB-bioW，Spec-bioF，PCR扩增法鉴定整合菌BI1。 设计引物Con-up和Con-down，以T载体为模板，PCR扩增出Con片断，从TA克隆的质粒BL46上用限制性内切酶KpnI和ApaI消化，与相同酶切消化回收的E3骨架连接，得到质粒BL57。设计引物Cm-up和Cm-down，以PDL为模板，PCR扩增出Cm基因，用限制性内切酶ApaI和BamHI消化TA克隆的质粒BL47，与相同酶切消化回收的BL57载体连接，得到质粒BL59。同样设计引物pglvW-up和pglvW-down，从实验室已构建好的质粒QJ34上PCR扩增出启动子pglv与bioW基因，TA克隆的质粒为BL48，用限制性内切酶BamHI和SacI消化，与相同方式酶切消化回收的E3骨架连接，得到质粒BL56。再用限制性内切酶KpnI和BamHI消化BL59，回收Con片断和Cm基因，用相同的酶消化回收的BL56载体连接，得到最终的双交叉载体BL60。 用限制性内切酶ScaI线性化质粒BL60，由于Con片断和bioW基因分别同源于单交叉整合菌BI1染色体上的同名基因，因此，它们之间的Cm基因和pglv启动子通过双交叉整合方式替换掉枯草杆菌BI1原来染色体上的Spec抗性基因和Pbio启动子，得到整合菌BI2，通过PCR扩增方式初筛。从Cm5μg/ml逐渐提高Cm抗性浓度到80μg/ml，BI2可正常生长，通过Southernblotting可检测到5～15个拷贝数。通过微生物法和高效液相色谱法测定了生物素的表达量。 试验结果表明，将强的启动子pglv启动子整合到宿主菌染色体，以及通过Cm提高生物素基因拷贝数，提高了生物素操纵子基因的表达效率，为提高生物素的产量建立可行的研究路线和理论依据。