背景和目的正畸治疗过程中,牙齿在正畸力的作用下发生移动,其生物学基础在于牙周组织在应力刺激下发生改建。正畸力经牙齿传递到牙周组织,牙周膜在这一过程中发挥了桥梁作用。牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts, PDLFs)是牙周膜的主要构成细胞,在应力刺激下能合成细胞因子并通过胞内信号传递系统影响细胞行为(增殖,分化,凋亡等),从而介导牙周组织的改建,修复和再生。研究应力刺激在PDLF胞内的信号转导以及对PDLF行为的影响,对于阐明正畸力作用下牙周组织改建的分子机理,发现有利于促使牙齿移动的力学环境都具有重要意义。成骨细胞是促进骨基质分泌和矿化的主要细胞。核心结合因子a1 (core binding factor al, Cbfal),又称Runt相关转录因子2(]runt related transcription factor 2, Runx2),是学者们公认的最重要的成骨细胞特异性转录因子之一。Runx2蛋白能特异性结合许多成骨基因启动子上的顺式作用元件,并促进成骨靶基因的转录表达。虽然Runx2基因和蛋白的表达水平在矿化组织和成骨细胞系中远远高于一些非骨组织来源的细胞,但是目前越来越多的研究表明其基因和蛋白水平与成骨细胞的功能和分化并不是直接线性相关,而Runx2蛋白的活化状态也是其发挥功能的重要影响因素。目前,学者们一致认为Runx2是联系胞外成骨诱导因素和胞内影响成骨细胞功能分化的信号通路的枢纽。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2, ERK1/2)是最先被发现并且最具有代表性的有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)家族的成员。经胞外刺激因素活化后的ERK1/2可以进一步影响其下游转录因子的表达和活化。有研究表明Runx2是 ERK1/2众多下游靶基因中的一员,但是ERK1/2-Runx2通路是否可以在应力刺激下的PDLF中被激活还未知；如果其确实参与了应力刺激下PDLF的成骨分化,其具体的分子机理也有待深入研究。本研究首先通过携带Runx2基因的慢病毒载体转染原代培养的PDLF,探究Runx2对PDLF成骨分化的作用,然后构建了PDLF体外培养一应力刺激模型,观察Runx2和其他相关成骨基因在应力刺激下的表达变化,以及ERK1/2通路在应力刺激下的激活情况；最后通过比较对正常PDLF 和P Runx2过表达PDLF实施应力刺激,以及特异性阻断ERK1/2通路对应力刺激PDLF成骨分化的影响,研究ERK1/2 和 Runx2在介导应力刺激促进PDLF成骨分化过程中发挥的作用,对应力刺激,ERK1/2, Runx2,以及PDLF的成骨基因表达这几个因素之间的关系进行阐述,以明确ERK1/2-Runx2通路介导应力刺激调控PDLF成骨分化的分子机理,为临床正畸矫治提供新的分子生物学基础。主要实验方法及结果1牙周膜成纤维细胞的分离培养及鉴定采用组织块联合酶消化法对牙周膜成纤维细胞进行分离培养,并绘制细胞生长曲线。免疫细胞化学染色结果显示角蛋白染色为阴性,波形丝蛋白染色为阳性,HE染色胞浆伊红,胞核嗜碱性。成纤维细胞特异性表面蛋白1(FSP1)免疫荧光染色阳性。2稳定过表达Runx2基因的PDLF的构建及Runx2对PDLF的成骨诱导作用利用Ⅱ型Runx2基因以及LV5慢病毒载体构建LV5-Runx2慢病毒载体。有限稀释法测定病毒液滴度为6x105TU/ml。通过靶细胞侵染预实验对MOI值以及Puromycin筛选浓度进行摸索,最终获取稳定过表达Ⅱ型Runx2的牙周膜成纤维细胞。荧光定量PCR以及Western Blot证实稳定转染LV5-Runx2的牙周膜成纤维细胞中Runx2的nRNA和蛋白水平都升高显著。荧光定量PCR结果显示Ⅱ型Runx2过表达可以有效促进PDLF中成骨转录因子SP7,骨钙素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的转录表达,但对1型胶原(COL-1)和碱性磷酸酶(ALP)的表达无影响,并且轻微抑制转录激活因子4(ATF4)的表达。茜素红染色实验证实Ⅱ型Runx2过表达的PDL F体外培养3周后可以观察到钙结节。3周期性张应力刺激体外培养的牙周膜成纤维细胞模型构建使用多通道细胞体外牵张应力加载系统,对体外培养的牙周膜成纤维细胞施加振幅10%,频率0.5HZ的周期性牵张力,加力作用时间为1h,3h,6h,12h,18h,24h,以不加力组作为对照组,采用荧光定量PCR测定并绘制成骨基因Runx2, SP7, OCN, BSP和ATF4的mRNA随加力时间延长而变化的表达曲线；利用Western Blot和免疫沉淀法测定Runx2蛋白水平在不同加力时间点的表达,以及Runx2 和 ERK1/2在不同加力时间的激活情况。结果证实了周期性张应力可以促使牙周膜成纤维细胞中上述成骨基因的表达,并且在这一过程中同时伴随Runx2和ERK1/2通路的磷酸化。4ERK1/2-Runx2通路介导了周期性张应力刺激下牙周膜成纤维细胞的成骨分化对正常PDLF和过表达Runx2的PDLF分别进行应力刺激3h,荧光定量PCR结果显示周期性张应力刺激以及Lunx2过表达对牙周膜成纤维细胞中成骨基因SP7, OCN和BSP的mRNA表达有协同促进作用,即对Runx2过表达的PDLF同时施加应力刺激比不加力的Runx2过表达PDLF或者加力的正常PDLF对上述成骨基因的转录刺激作用更强。对加力组PDLF同时应用ERK1/2通路的特异性抑制剂U0126后,上述成骨基因的转录表达水平较单纯加力组有所下降。通过对正常PDLF和过表达Runx2的PDLF中Runx2的mRNA和蛋白水平的测定,发现应力刺激都可以诱导Runx2基因的转录和翻译,但ERK1/2通路被抑制后,Runx2的mRNA水平显著下降,而蛋白水平无明显变化,说明应力刺激对Runx2的转录表达可以通过ERK1/2介导,但ERK1/2对Runx2蛋白的翻译过程影响不大。通过测定Runx2的蛋白磷酸化水平(p-Runx2),发现p-Runx2的表达趋势与上述成骨基因的表达趋势高度一致,从而推测ERK1/2-Runx2通路介导应力刺激对牙周膜成纤维细胞的成骨分化的机制在于提高Runx2蛋白表达水平的同时对其进行磷酸化修饰以提高Runx2蛋白的转录激活功能。进一步研究发现ERK1/2蛋白主要存在于胞浆中,而Runx2蛋白则存在于胞核中；应力刺激激活ERK1/2后促使p-ERK1/2进入胞核并与Runx2形成蛋白复合体,推测这为p-ERK1/2对Runx2的磷酸化修饰提供了条件；U0126抑制了应力刺激下ERK1/2的活化,从而阻止p-ERK1/2进入细胞核并激活Runx2。结论1. Runx2对牙周膜成纤维细胞的成骨分化具有促进作用,可提高下游成骨靶基因SP7, OCN和BSP的转录水平的表达。2.周期性张应力刺激可以促进牙周膜成纤维细胞成骨基因SP7, OC N和BSP的转录表达；Runx2基因的mRNA和蛋白表达水平也同时升高,并伴随Runx2蛋白和ERK1/2通路的磷酸化。3. ERK1/2-Runx2通路介导周期性张应力刺激促进牙周膜成纤维细胞成骨分化的机制在于提高胞内Runx2蛋白的磷酸化水平(p-Runx2),从而促进Runx2下游成骨基因的转录表达；Runx2总蛋白水平与下游成骨基因转录表达无相关性。应力刺激激活ERK1/2进入细胞核中与Runx2形成蛋白复合体,猜测这为p-ERK1/2对Runx2的磷酸化提供了条件；阻断ERK1/2通路影响了应力刺激对ERK1/2的激活以及入核,从而影响了Runx2蛋白的磷酸化修饰和成骨基因的转录表达。创新和意义本课题从细胞分子水平证实了ERK1/2-Runx2通路参与了周期性张应力刺激下牙周膜成纤维细胞的成骨分化,并进一步探讨了其具体的机制,认为Runx2的磷酸化水平的而非总蛋白水平在调控下游成骨靶基因转录表达方面起到至关重要的作用；而应力刺激下活化的ERK1/2则在转录水平提高Runx2的表达并同时进入细胞核与RLunx2蛋白结合以促使Runx2蛋白的磷酸化。以上观点为临床正畸治疗过程中牙周组织的骨改建提供新的分子靶点和思路。