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目的:本实验通过分离大鼠间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),使用携带IL-35基因片段的表达载体转染MSCs细胞,在体外建立MSCs与DC、T细胞共培养体系,探讨修饰后的MSCs的免疫调节作用。方法:(1)无菌条件下分离Sprague-Dawley(SD)大鼠股骨和胫骨,使用全骨髓贴壁法培养MSCs,胰酶消化传代培养。待培养至第3代时进行流式检测,鉴定分离的MSCs体外分化的潜能。(2)使用LPS处理3天的人外周血单核细胞c DNA为模板,扩增获得EBi3和p35基因片段,再通过重叠PCR方法,人工合成了IL-35片段,将其克隆进真核表达载体p MSCV-IRES-GFP中,提取质粒后瞬时转染MSCs,Real-time PCR检测修饰后的MSCs基因表达情况,ELISA检测细胞上清中IL-10、TGF-β1、IL-12的分泌情况。(3)密度梯度离心法分离培养Wistar大鼠骨髓未成熟DC细胞,建立修饰后的MSCs与DC细胞的体外共培养体系,分为直接接触组和间接接触组,流式检测共培养48小时后DC表型的变化,ELISA检测DC细胞分泌IL-12的变化情况。(4)建立修饰后的MSCs与脾脏T细胞的体外共培养体系,分为直接接触组和间接接触组,流式检测CD8+T细胞和CD4+CD25+调节T细胞(Tregs)水平,MTS检测T细胞增殖,Real-time PCR检测与T细胞共培养后MSCs的IL-10和TGF-β基因表达情况。结果:(1)使用全骨髓贴壁法培养的MSCs成细长梭形状,形似成纤维细胞,排列均匀,成漩涡状生长,流式检测其高表达CD29、CD44和CD90分子,分别为84.12%、90.77%、97.27%,而几乎不表达造血系的CD34和CD45分子,分别为1.87%、1.06%。证实所获得的MSCs为典型的间充质干细胞,第三代MSCs在体外经诱导后可向脂肪细胞和软骨细胞分化,证实其具有良好的分化潜能。(2)PCR扩增获得630bp的EBi3片段和590bp的p35成熟片段,通过重叠PCR的方法,人工合成了IL-35基因片段(1.3kb),并成功将其克隆进真核表达载体p MSCV-IRES-GFP中,双酶切鉴定显示连接成功。提取质粒后瞬时转染MSCs,检测到修饰后MSCs表达IL-35显著增强,同时与IL-35相关的免疫因子IL-10和TGF-β1的表达也明显升高。ELISA检测细胞上清显示转染修饰的MSCs分泌IL-10和TGF-β1水平明显增高,而IL-12的分泌水平明显下降。(3)通过密度梯度离心法获得大鼠DC,流式检测其表面成熟分子标志物CD86、CD11b/c、MHC-Ⅱ处于较低水平,分别为45.11%、70.15%、82.56%。使用LPS诱导后,CD86、CD11b/c、MHC-Ⅱ水平明显升高,分别为78.2%、97.1%、99.47%。在MSCs与DC共培养体系中加入LPS诱导DC成熟,DC的最主要成熟标志CD86仍处于较低水平,MSC-IL35组和直接接触组中显示出更强劲抑制效力。共培养后细胞上清ELISA显示DC分泌的IL-12水平明显下降,且在MSC-IL35组下降更为明显。(4)通过红细胞裂解法获得大鼠脾脏T细胞,MSCs与T细胞共培养后降低了CD8+T水平,增加了CD4+CD25+Tregs水平,MSC-IL-35的作用更为明显,MTS检测显示在共培养后24小时和48小时,MSCs明显抑制了T细胞的增殖,而MSC-IL-35的抑制作用更加明显。Real-time PCR检测结果显示与T细胞共培养后MSCs的IL-10和TGF-β1基因表达显著增强,其中与T细胞直接接触组效果更为明显。结论:转染修饰后的MSCs能通过直接接触和分泌细胞因子来抑制LPS所诱导的DC细胞的成熟,降低T细胞亚群CD8+T细胞的比例,增加CD4+CD25+Tregs水平,且比普通MSCs效果更为明显,IL-35修饰后的MSCs具有更为强大的免疫调节效力,在器官移植耐受领域有更大的应用前景。