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UDP-葡萄糖4-差向异构酶在细菌和哺乳动物半乳糖代谢机制中介导UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的相互转化。UDP-葡萄糖4-差向异构酶属于短链脱氢酶／还原酶超家族,通过生成暂时性酮类中间产物和颠倒该中间产物C4位立体化学构型实现UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖相互转化的最后一步反应。热荚硫细菌KA3是一种嗜热、厌氧、化学有机营养型的硫还原细菌,2002年从温度65℃、静水压力30MPa的深海热液烟囱样品中通过加富培养获得,是首例真正意义上的耐高温耐高压细菌,该物种最适生长温度和压力为65℃和40MPa。热荚硫细菌KA3的UDP-葡萄糖4-差向异构酶由337个氨基酸组成,在朝向底物结合位点的Si面紧密结合一分子的辅助因子NAD+,其中保守序列赖氨酸、酪氨酸和丝氨酸在结合底物、传递质子和产生活性过程中发挥着至关重要的作用,与大肠杆菌K12UDP-葡萄糖4-差向异构酶的同源性为56%。为了减少异源蛋白在大肠杆菌中表达的生物屏障,根据NCBI提供的基因序列,在试验初期从密码子偏爱性和mRNA翻译起始区二级结构等方面对UDP-葡萄糖4-差向异构酶的基因序列进行了优化,有助于大肠杆菌高效和稳定地表达外源酶蛋白。根据NCBI提供的基因序列,利用Prime Primer5.0软件设计特异性引物,采用PCR扩增目的基因,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定为分子量大小约为lkbp的特异性条带。DNA扩增产物纯化后和载体pET-28a(+)分别经限制性内切酶HindⅢ和Nde I双酶切,酶切产物回收后经T4DNA连接酶处理,连接产物洗涤纯化后在电容25μF、电压2500v、电阻500Ω条件下导入克隆菌株E.coli DH5a感受态细胞中,涂布于含Kan的LB固体培养基,过夜培养后随机挑取白色单菌落进行PCR鉴定和双酶切鉴定,结果显示：10个白色单菌落中有3个菌落为阳性克隆,其余为假阳性克隆。抽提阳性克隆中的重组质粒通过CaCl2法转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,涂布于含Kan的抗性平板后过夜培养得到工程菌E. coli BL21(DE3)(pET-gale)。a工程菌E.coli BL21(DE3)(pET-gale)于37℃、250r/min条件下振荡培养12～16h,转接1mL培养物于50mL LB培养基中培养2h,在一定诱导剂浓度和诱导温度下可以表达目标酶蛋白,对诱导表达条件的优化试验发现,当IPTG终浓度为0.1mM、诱导温度为27℃、诱导时间为4h时可以获得大量活性目标蛋白。Ni2+亲和层析一步纯化后,比酶活由0.517U/mg蛋白上升至9.440U/mg蛋白,纯化倍数和回收率分为18.26倍和57.08%。经SDS-PAGE电泳鉴定,分子量大小接近40kDa,电泳条带清晰,杂蛋白较少。在柱型为Athena NH2、流动相为KH2PO4缓冲液(0.125M、pH3.6)：乙腈=40：60(V：V)、流速为1.0mL/min、检测波长为254nm色谱条件下检测目标蛋白活性,UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的保留时间分别为17.130min和15.748min,两者混合进样时,UDP-半乳糖较UDP-葡萄糖先出峰,峰型尖锐,分离效果较好。UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖两种物质的标准曲线线性良好,相关系数分别为0.9986和0.9988,检出限分别为5.8ng和3.4ng,灵敏度较高,回收率分别为95.57%和96.48%,相对标准偏差分别为6.2%和7.8%,精密度较高。在35℃、pH8.0条件下,目标蛋白对底物UDP-葡萄糖异构化活性较高,酶活力为19nmol/min,转化率为77.71%。以UDP-葡萄糖为底物,目标蛋白在pH为7.0～9.0、温度为35℃～45℃范围内具有较高的酶活性,酶活力高于15nmol/min,最适pH和最适温度分别为8.0和40℃～45℃。在最适pH和最适温度下,目标蛋白对底物UDP-葡萄糖的米氏常数Km为0.76mM,最大反应速率vm为11.89nmol/min。除了辅助因子NAD+, Ca2、Mg2+和Mn2+对目标蛋白具有激活作用,Cu2+和Hg2+对该目标蛋白具有较强的抑制作用,较小的离子浓度即可导致酶活力降低。有机溶剂的极性越大,对酶活力的抑制作用越强,SDS和PMSF能较大程度抑制酶活性,Tween-80和EDTA对酶活性抑制作用较小。