布氏杆菌为胞内寄生菌，主要寄生于机体的单核细胞（主要是巨噬细胞）内，在细胞内的生存和复制是布氏杆菌的主要毒力特征。非编码小RNA(small nocoding RNA，sRNAs)是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子，在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用。细菌中的sRNA有两种形式:顺式编码sRNA和反式编码sRNA。反式编码sRNA与靶标基因的mRNA不完全碱基配对，调控mRNA的稳定性或是改变翻译机制，细菌中以这种非编码RNA为主。这类小RNA主要分布在蛋白编码序列之间，即基因间区。在革兰氏阴性菌中，Hfq可以辅助小RNA与靶标基因的互补配对。本实验室在前期的研究中通过生物信息学预测和Northern实验验证，在羊布鲁氏菌的两条染色体上共发现了15个新的sRNA，BSR1141即为其中之一。本研究在前期研究的基础上，对BSR1141在布鲁氏菌在适应宿主内环境中的调控作用进行了深入的研究。　　试验Ⅰ布氏杆菌sRNA-BSR1141的预测及鉴定　　为了进一步验证sRNA-BSR1141的存在及分析其分子特征，本研究首先通过首先通过RACE方法寻找BSR1141的转录起点和终点，并通过MFOLD软件预测其二级结构。然后利用RT-PCR和Northern的方法，分析BSR1141RNA在各种条件下的转录水平。最后通过RT-PCR分析BSR1141与hfq的相关性。RACE结果表明BSR1141位于布氏杆菌Ⅰ号染色体BMEI1140和BMEI1141之间基因间区的正义链上，方向为←→←，长73 nt。它的转录起点为1187396，转录终点为1187668。RT-PCR和Northern结果发现BSR1141在模拟巨噬细胞内环境的刺激条件下表达水平增加，提示BSR1141有可能在布鲁氏菌适应宿主细胞内环境压力中发挥作用;同时也表明BSR1141是hfq依赖性sRNA。　　试验Ⅱ布氏杆菌BSR1141突变株的构建及表型试验　　为了进一步确定BSR1141在布鲁氏菌适应宿主内环境和胞内生存中的作用，本论文构建了BSR1141缺失突变株和过表达株，并对野生株、BSR1141缺失突变株及过表达株的胞内生存相关表型进行了比较，包括生长速度、体外模拟巨噬细胞内环境条件下的生存能力及小鼠毒力。结果显示:与野生株相比，BSR1141突变株和过表达株生长速度减慢、在体外刺激条件下的生存能力降低、小鼠感染后脾脏载菌数下降，证实BSR1141与布鲁氏菌的胞内生存和毒力密切相关。　　试验Ⅲ BSR1141通过靶标基因来介导布氏杆菌毒力及环境适应力　　由于sRNA主要通过靶标mRNA来发挥作用，为了从基因水平上进一步探讨BSRi141在胞内生存中如何发挥作用。本试验通过TargetRNA、 RNAPredator、sTarPicker这3种常用的生物信息学软件对BSR1141的靶mRNA进行预测并通过RT-PCR进行验证。结果表明生物信息学预测得到了43条靶mRNA，包括布氏杆菌毒力因子VirB2、外膜蛋白、转录调控因子(tetR、GntR)、热休克蛋白及一些代谢相关基因等，且BSR1141对大部分靶标基因表现为负调控，这提示BSR1141可能就是通过调控大量靶标基因，影响了菌体的毒力、代谢、生长能力以及对不利环境的抵抗力，从而导致表型上的改变。　　virB操纵子由同一启动子调控编码Ⅳ型分泌系统(TypeⅣ secretion systems，T4SS)，它是一个含有11个可跨越细菌被膜的多蛋白复合物，是病原菌的一个重要毒力武器，而virB2是T4SS成员之一，已有研究表明virB2缺失后，布氏杆菌毒力下降。GntR和tetR作为一种很广泛存在的转录调控因子，能够与相关基因的启动子区域相结合来实现对靶基因的调控作用。本试验在上述试验基础上选择毒力基因virB2及转录调控因子GntR和tetR进一步研究BSR1141对靶标基因的具体调控机制，首先通过在线预测软件sTarPicker预测出BSR1141与三个靶标可能的结合位点，然后通过双质粒系统试验进一步验证BSR1141于这3个靶mRNA的结合;最后结合qRT-PCR分析BSR1141对T4SS整体的调控作用。结果表明:BSR1141分别与GntR mRNA的5UTR和tetR mRNA的编码起始位点发生不完全互补配对，抑制GntR和tetR的翻译水平，这提示BSR1141可能通过下调GntR和tetR的蛋白表达水平，从而影响GntR和tetR作为一个转录调控因子的下游效应，进而呈级联放大效应，调控菌体的毒力、初级代谢、抗生素代谢及胞内生存能力。同时BSR1141通过靶基因virB2的5UTR不完全互补配对，调控virB2的表达，而且这个过程需要分子伴侣Hfq的参与。然而qRT-PCR结果表明BSR1141对整个virB族基因转录水平存在影响，除virB2外，其余的10个virB基因均受BSR1141的负调控作用，这提示BSR1141除了直接上调virB2的表达，还间接影响其它virB基因的表达，因此BSR1141整体上对T4SS呈负调控作用，从而降低了菌体毒力水平，不利于布鲁氏菌在各种条件下的生存能力。　　试验Ⅳ sRNA(BSR0602和BSR1141)通过双向调控sodA的表达介导内源性氧代谢　　SodA是锰超氧化物歧化酶，广泛存在于微生物体内，是生物抗氧化酶类的重要成员，维持布氏杆菌体内活性氧代谢平衡。本实验室在前期实验中发现sodA是布氏杆菌另一个sRNA-BSR0602的靶标基因，而在本试验中发现BSR1141与布氏杆菌抵御胞内恶劣环境有关，特别是对氧压特别敏感;且sodA也是BSR1141的靶标基因之一。以sodA为研究对象，进一步研究BSR1141和BSR0602是如何调控布氏杆菌对氧压的适应性。本研究通过双向电泳技术对布氏杆菌野生株16M和BSR0602过表达株的全菌蛋白谱进行比较分析，结果显示BSR0602过表达后，布氏杆菌转运代谢蛋白和压力适应蛋白的表达发生变化。qRT-PCR和HIS表位标记实验结果进一步证实BSR0602和BSR1141在转录和翻译水平均影响氧压力适应蛋白SodA的表达。相关表型实验结果显示16M-BSR0602和16M-BSR1141对氧压力更为敏感，证实了BSR0602和BSR1141在布氏杆菌适应氧压力中的作用。这提示BSR0602和BSR1141这两个sRNA共同调控sodA基因的表达，相互协作，维持内源性氧代谢的动态平衡。　　通过本试验，本论文在布鲁氏菌中发现了一个新的与毒力和胞内生存能力相关的sRNA BSR1141。BSR1141通过下调GntR、tetR和virB族基因的表达来影响布鲁氏菌的毒力以及布鲁氏菌在宿主细胞内的生存能力。由于BSR1141下调而不是增强布鲁氏菌的毒力，因此影响BSR1141的表达水平，将有可能阻断或抑制细菌的致病力，从而达到抗感染的目的，这可以作为一个新颖的抗感染策略基础。