【摘 要】
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非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）是非洲猪瘟病毒属下的唯一成员,是目前唯一的虫媒DNA病毒,强毒株在猪群中造成的死亡率高达100%,·目前仍无有效的疫苗用于预防。ASFV编码将近200种蛋白质,其致病与逃避宿主免疫系统机制的复杂程度可想而知,因此在攻克ASFV疫苗的同时,对ASFV的检测和杀灭对于防控非洲猪瘟疫情的暴发至关重要。本研究以国内ASFV基因II
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（32170161）； 国家自然基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）；
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非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）是非洲猪瘟病毒属下的唯一成员,是目前唯一的虫媒DNA病毒,强毒株在猪群中造成的死亡率高达100%,·目前仍无有效的疫苗用于预防。ASFV编码将近200种蛋白质,其致病与逃避宿主免疫系统机制的复杂程度可想而知,因此在攻克ASFV疫苗的同时,对ASFV的检测和杀灭对于防控非洲猪瘟疫情的暴发至关重要。本研究以国内ASFV基因II型流行毒株GZ201801为参考,以编码的免疫逃逸蛋白EP153R为研究对象,具体研究内容如下:1.EP153R蛋白生物信息学分析与N糖基化位点的初步鉴定为了对EP153R蛋白有一个初步的了解,本研究首先利用Prot Param等工具对EP153R蛋白进行生信分析,发现EP153R蛋白为亲水性的、稳定的跨膜蛋白,蛋白中存在着N糖基化、磷酸化等修饰位点;利用Alphafold 2.1预测EP153R蛋白的三维结构整体呈宽扇镰刀状。为了验证EP153R蛋白的N糖基化修饰,我们对EP153R蛋白中预测的7个N糖基化位点进行定点突变,将其突变体命名为EP153R（7NS）,利用不同浓度的衣霉素处理了EP153R和EP153R（7NS）蛋白,通过Western Blot发现EP153R（7NS）蛋白分子量明显小于EP153R,说明了EP153R蛋白确实会发生N糖基化修饰,且预测位点大概率正确。本研究为EP153R蛋白后续功能与机制的研究奠定了一定的基础。2.基于重组EP153R蛋白检测ASFV抗体间接ELISA方法的建立为了探究EP153R蛋白的功能和建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,本试验构建了EP153R蛋白杆状病毒表达系统,采用Western Blot与IFA鉴定EP153R蛋白的表达和免疫原性,结果显示,杆状病毒能高效表达EP153R蛋白且可被小鼠多抗识别,具有良好的免疫原性。以此重组蛋白为抗原进行间接ELISA方法的建立,经方阵试验确定了最佳反应条件;以优化后的条件确定了抗体阳性临界值;特异性试验结果表明,该方法仅与ASFV阳性血清发生反应,重复性试验结果显示变异率小于10%,重复性良好。利用该方法对46份猪血清进行检测,与商品化试剂盒检测结果对比显示,符合率为91.3%,能较好区分ASFV血清的阴阳性。本研究的结果为后续EP153R功能研究和ASFV临床血清学诊断奠定了基础。3.构建ASFV-EP153R-HA-mCherry荧光毒用于对消毒剂的评价为了准确评估两种季铵盐类消毒剂（JN-01/02）在室温条件（25℃）对ASFV的灭活作用,我们构建了ASFV-EP153R-HA-mCherry红色荧光重组毒用于本次消毒剂评估。为了评估消毒剂是否对ASFV-EHM有消杀作用,我们将不同浓度的JN-01/02分别与ASFV-EHM溶液混合在室温下孵育后转移至BMDM细胞中,初步判定两种消毒剂可以抑制ASFV-EHM对BMDM的感染;接着在相同的处理条件下测定各个处理组中ASFV-EHM的滴度变化,以灭活对数值≥4为有效灭活标准,结果显示,0.15%和0.2%JN-01作用30min和60min都可以有效灭活ASFV-EHM;0.2%JN-02作用60min可以有效灭活ASFV-EHM;此外我们还评估了消毒剂安全消杀条件;在消毒剂安全消杀条件下,我们进一步确定了0.2%JN-01处理10min可以消杀10~4TCID50/m L的ASFV-EHM,0.2%JN-02处理40min可以消杀10~5TCID50/m L的ASFV-EHM,整体来说两种消毒剂对ASFV-EHM具有良好的灭活效果。本研究为后续消毒剂配方的更新、新型消毒剂的研发和ASFV消毒剂评价体系的建立提供了初步的参考。
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