肺癌是目前重要的一种肿瘤，其发病率高，死亡率也高，且近年来增长迅速。肺癌根据其临床特点和生物学特性可以分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)两大类，后者占肺癌总数的80％左右。大部分肺癌患者发现即处于进展期，失去手术机会。对于这部分晚期病人而言，目前有效的手段主要是放疗和化疗以及靶向治疗和生物治疗。 靶向治疗是指抗肿瘤药物特异地作用于肿瘤细胞中的某些靶点，如信号通路的某一环节位点。这种利用癌细胞和正常细胞信号传导通路的差异而设计的抗癌药物，显示了与传统细胞毒药物完全不同的毒副作用，目前在肺癌领域里应用到临床的靶向治疗药物本研究从两个方面进行探讨： 第一部分通过分析接受吉非替尼治疗的NSCLC患者EGFR突变状态与临床特征和预后的关系得出19外显子缺失突变和21外显子点突变预后不同的观点，通过体外实验探讨两种突变对TKI的敏感性的差异。第二部分则通过对肺癌细胞系的实验对联合两个靶向药物(EGFR抑制剂和mTOR抑制剂)的疗效和作用机制进行探讨。 第一部分非小细胞肺癌中EGFR．TK突变与吉非替尼的敏感性 第1章非小细胞肺癌患者19外显子缺失与21外显子点突变对吉非替尼敏感性比较 目的: 分析吉非替尼治疗EGFR19外显子缺失突变和21外显子点突变的非小细胞肺癌患者疗效和生存的差异。 方法: 回顾分析广东省人民医院和北京协和医院2003年5月至2004年3月期间服用吉非替尼且随访资料完整，并有冻存或石蜡组织标本进行EGFR外显子测序的患者。 结论: 尽管两组患者在治疗反应率上没有差异，但19外显子缺失患者吉非替尼治疗后的生存期优于2l外显子点突变患者，差异具有统计学意义。 第2章稳定表达野生型及突变型EGFR的293细胞系的建立 目的: 通过分子克隆技术及逆转录病毒包装系统，利用转染的方法构建出表达全长野生型EGFR、de1746-750、L858R、de1746-750+L858R双突变的293细胞系，以利于进一步研究不同突变对TKI反应性的差异。 方法: 限制性内切酶XhoI酶切，获得pcDNA3.1(-)质粒中的野生型EGFR和del746-750、L858R、del746—750+L858R突变的DNA片段，使用去磷酸酶去除5’末端磷酸根。同样限制性内切酶处理逆转录病毒包装质粒pLNCX2，获得载体片段。使用T4连接酶连接载体与目的片段。转化所得质粒，扩增后转染至包装细胞PA317，收集含逆转录病毒的培养液上清，感染目的细胞293细胞。新霉素抗性标记筛选阳性克隆，以绿色荧光蛋白质粒为阳性对照，Western-blotting确认细胞表达相应的EGFR基因。 结论: 通过分子克隆技术成功构建野生型EGFR、de1746-750、L858R、de1746—750+L858R质粒；利用逆转录病毒包装系统成功构建稳定表达上述质粒的293细胞系。 第3章19外显子缺失与21外显子点突变对吉非替尼敏感性差异机制探讨 目的: 探讨EGFR外显子de1746-750和L858R突变对吉非替尼的磷酸化抑制作用在受体不同位点上的差异。转染不同突变体后293细胞对TKI敏感性的差异及对下游信号通路的影响。 方法: 通过细胞计数的方法测定转染de1746-750和L858R突变的细胞的生长曲线及加入吉非替尼后生长抑制情况，用流式细胞技术对不同作用时间下两种突变细胞进行细胞周期分析。利用Westem-blotting的方法检测不同浓度吉非替尼作用下两种突变细胞在EGFR几个磷酸化位点上的抑制程度的差异及对下游Akt和Erk1/2磷酸化的影响。 结论: 两种突变细胞对吉非替尼的反应性不同，缺失细胞更容易受到TKI的抑制，这种差异来自TKI对EGFR磷酸化不同位点的抑制作用的差异，及其导致的下游信号上的差异。 第4章T790M突变质粒构建及对吉非替尼敏感性 目的: 利用野生型EGFR质粒通过定点突变的技术构建出含有T790M突变的EGFR质粒，对突变后EGFR对吉非替尼的反应性进行研究。 方法: 设计包含T790M的引物，通过PCR的方法扩增包含野生型EGFR的质粒，在质粒中引入新的突变。利用限制性内切酶Dpnl将无突变质粒切碎，保留引入突变后的质粒，转化至感受态细菌。测序验证质粒中引入所需T790M突变，扩增质粒。突变后的T790M质粒转染至293T细胞，加入不同浓度的吉非替尼，Western—blotting方法观察磷酸化EGFR受抑制情况。 结论: 研究提示，T790M突变为活化突变，吉非替尼对其磷酸化抑制能力较野生型EGFR低。 　　第二部分吉非替尼与RAD001在肺癌细胞中联用的疗效观察及对下游信号通路的影响 　　前言 在前面章节中已述，对于肺癌患者而言，尽管小分子酪氨酸激酶抑制剂的出现给治疗带来了新的希望，但是绝大部分患者最终仍然出现疾病的进展和耐药；借鉴化疗药物从单个有效的药物到两药多药联合的发展历史，可考虑多个靶向药物联合应用以改善单一靶向药物的不足。本章将靶向EGFR的吉非替尼(gefitinib)与另一个靶向mTOR的抑制剂依维莫司(everolimus，RAD001)联合，从体外细胞层面和下游信号通路上对两药联合进行疗效的观察和机制上的探讨。 目的: 观察联合应用吉非替尼和RAD001对肺癌细胞系的抑制作用和对下游信号通路的影响。 方法: 通过MTT增殖抑制实验观察单药吉非替尼与吉非替尼联合RAD001对肺癌细胞A549和H460的抑制作用。流式细胞技术检测上述单药和两药联合诱导H460细胞凋亡情况。Western-blotting检测单药与联合两药对下游信号通路中Akt和Erk1/2的影响。 结论: 联合应用两个靶向治疗药物在体外取得了较好的疗效，提示可将作用不同靶点的靶向治疗药物相联合做为一种新的治疗方案行进一步的研究。