ε-己内酯是一种重要的有机化工中间体,可以用于合成聚己内酯等高价值聚合物。而由于这些聚合物具有良好的热塑性、药物渗透性、生物降解性和成型加工性以及生物相容性和无毒性,使得ε-己内酯在材料、环保、医疗等领域具有良好的应用前景。目前化学合成ε-己内酯的过程较为繁琐、物耗和能耗高且不环保,因而选择高效率、高选择性特点的生物催化法合成ε-己内酯更为绿色和经济。本研究设计了以环己醇为底物,经环己酮中间产物生产ε-己内酯的全细胞合成路线。该过程因醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)催化环己醇到环己酮产生 NADPH,偶联环己酮单加氧酶(cyclohexanone monooxygenase,CHMO)催化环己酮产ε-己内酯过程消耗NADPH,实现该级联酶促反应辅因子NADPH自循环平衡。为了提高该级联酶促催化效率,本研究分别考察了不同双启动子表达载体(pETDuet和pRSFDuet)对催化效率的影响,研究表明pRSFDuet占优,以20mM环己醇为底物,在16h内实现ε-己内酯转化率达60%,比相同条件下pETDuet为载体高16%。进一步,为了平衡细胞内NADPH的产生和消耗尽可能在同一水平,分别对ADH和CHMO表达盒中的RBS序列进行理性设计以调控对应编码酶的表达量,最终获得最优工程菌BDR-13。在催化60mM环己醇实验中,菌株BDR-13的ε-己内酯产量为52.5 mM,转化率达到87.5%。该菌株的产量是对照组(BDR-2)的1.7倍。为更进一步提高产量,本研究选取菌株BDR-13为生产菌株并尝试了分批补料催化实验,以40mM环己醇为底物,分4个批次补料添加进反应体系,最终ε-己内酯的产量高达126 mM,且第四个批次的转化率高达76%。本研究通过构建级联酶促反应,并理性设计调控各酶表达水平,从而尽可能实现大肠杆菌内辅因子NADPH的自平衡,提高了从环己醇经环己酮中间产物,高产ε-己内酯的催化过程。该菌株BDR-13的构建和获得,为ε-己内酯工业化生产提供可能,同时也为同类型胞内氧化还原反应体系构建提供了一种思路借鉴。