二色补血草(Limonium bicolor(Bag.)Kuntze)为白花丹科(Plumbaginaceae)补血草属(Limonium Mill.)多年生草本植物,广泛分布于海滨碱滩、草地沙丘和内陆盐碱地区。二色补血草是典型的泌盐盐生植物,又是常用的药用植物。本研究通过对盐胁迫下二色补血草植物学性状、生理生化指标的响应情况和酶蛋白、化学成分及其相关调控基因表达的变化情况的考察,阐释了二色补血草的耐盐机理,通过盐胁迫前后二色补血草化学成分的定性和相对定量分析,考察了盐胁迫条件下二色补血草主要药用成分的变化情况,发现了盐生环境对二色补血草药用成分的调控规律。研究结果可以为深入了解盐生植物耐盐机制和环境对植物次生代谢产物的影响提供参考,对二色补血草作为盐生植物在盐渍化土地的利用和作为中药材在医药学上的应用均具有重要意义。具体研究结果如下。1盐胁迫对二色补血草植物学性状、生理生化指标及化学成分的影响在盆栽条件下以0 mM、100 mM、200 mM、300 mM NaCl溶液对二色补血草进行浇灌处理,观察其植物学性状、生理生化指标及化学成分的变化情况,结果显示:二色补血草叶片和根的鲜重和干重起初受到了 NaCl的抑制,但随着处理时间的延长,100和200 mM处理组逐渐高于对照组,21天后干重最大值都出现在200 mM NaCl处理组,最小值都出现在300 mM组;随着处理时间的延长,组织含水率在100 mM组逐渐升高,在其它盐处理组逐渐下降:在100和200 mM NaCl处理下二色补血草叶片上表面和下表面的盐腺数量都显著增加,在200 mM时达到最大值,在300 mM时叶片上表面盐腺数量显著低于对照,叶片下表面盐腺数量与对照比没有显著差异;在300 mM NaCl浓度下,叶片Na+含量、丙二醛(MDA)含量和电解质渗出率(EL)值均显著大于对照,说明在此浓度下植株叶片积累了过量的Na+,致使细胞膜受到了伤害;叶片净光合速率(PN)在100和200 mM处理组显著高于对照组,而在300 mM处理组显著低于对照组,说明100和200 mM NaCl不同程度地促进了二色补血草生物量的合成,而300mMNaCl则抑制了其生物量的合成;随着盐浓度的增加,超氧化物岐化酶(SOD)活性呈先上升后下降的趋势,所有盐处理组均高于对照:过氧化物酶(POD)的活性呈逐渐下降趋势;过氧化氢酶(CAT)的活性在各组中没有明显差异。NaCl胁迫使二色补血草体内多酚和黄酮类物质发生了不同程度的变化,与对照组相比,总多酚和总黄酮的含量随着盐浓度的增加呈下降趋势,在叶中和根中含量最小值分别出现在300 mM组和200 mM组,并且差异显著;没食子酸和杨梅苷的含量在不同盐浓度下变化明显,叶中没食子酸含量在200mMNaCl处理下显著高于对照,而根中没食子酸含量在200和300 mM NaCl处理下显著低于对照;杨梅苷含量在叶中的最大值同样是出现在200 mM,而在根中盐处理组均高于对照,其中,NaCl浓度为100和200 mM时差异显著。分析认为,二色补血草的生物量、叶片Na+含量、电解质渗出率、MDA含量、光合特性等的变化趋势一致,表现了对200 mM以下浓度盐胁迫的良好的适应性,浓度高于300 mM后植株的生长会受到抑制。结论认为,二色补血草盐腺对体内Na+含量具有很强的调控能力,在200 mM浓度以下的盐胁迫下能使Na+含量一直保持在稳定状态,并且通过光合效率的提高、抗氧化酶活性的增强、黄酮、酚酸类抗氧化物质的合成及累积等增强自体防御能力,减少氧化损害,由此推断二色补血草的耐盐机理是通过提高叶片盐腺数量、提高光合效率、增强抗氧化酶活性以及加速积累一些次生代谢物来抵御高盐环境。2盐胁迫对二色补血草蛋白质组的影响运用蛋白质双向电泳(2-DE)方法获得了二色补血草在200 mMNaCl处理前后叶片和根的差异蛋白质组图谱,并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF MS)技术鉴定了差异表达蛋白。在叶片中鉴定得到了 38个差异蛋白,包括碳代谢相关蛋白(4%)、能量代谢相关蛋白(8%)、氨基酸代谢相关蛋白(26%)、脂质代谢相关蛋白(4%)、次生代谢相关蛋白(8%)、无机离子转运和代谢相关蛋白(8%),核蛋白生物合成相关蛋白(4%)、蛋白质转运和分子伴侣相关蛋白(30%)、细胞骨架相关蛋白(4%)、功能预测蛋白(4%)和未分类的蛋白。在根中鉴定得到了 41个差异蛋白,包括碳代谢相关蛋白(20%)、能量代谢相关蛋白(10%)、氨基酸代谢相关蛋白(17%)、无机离子转运和代谢相关蛋白(7%)、核蛋白生物合成相关蛋白(7%)、蛋白质转运和分子伴侣相关蛋白(13%)、细胞骨架相关蛋白(3%)、转录相关蛋白(3%)、胁迫防御相关蛋白(3%)、信号转导相关蛋白(3%)、细胞壁/细胞膜的生物合成相关蛋白(7%)、胞内分泌和膜泡运输相关蛋白(7%)以及未分类的蛋白。结论认为,二色补血草可通过光合作用、碳和能量代谢、次生代谢、离子转运和代谢及胁迫防御等多种途径的协同作用适应一定程度的盐胁迫。这一结论在蛋白质组水平为深入探讨盐生植物的耐盐机制提供了有用的信息。3盐胁迫对二色补血草化学成分的影响运用超高效液相色谱联合四级杆飞行时间串联质谱(UPLC/Q-TOF-MS)技术对二色补血草在200mMNaCl处理前后的化学成分进行了分析,结果从二色补血草的叶片和根中鉴定了 11种化合物,分别是柠檬酸三乙酯(1)、没食子酸(2)、香草酸(3)、香草酸衍生物(4)、香草酸-葡萄糖苷/半乳糖苷(5)、N-(2-羧乙基)亚氨基二乙酸(6)、表没食子儿茶素没食子酸酯(7)、杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷(8)、杨梅素-3-O-α-L-鼠李糖苷(9)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(10)、杨梅素-3-O-β-D- (6″-没食子酰基)-半乳糖苷(11)。盐胁迫前根和叶中的化合物种类基本相似但含量差异显著,化合物6只出现在叶中,化合物4只出现在根中,化合物1、3、7、8和9在根中的含量显著大于在叶中的含量,化合物2、5、10和11在叶中的含量显著大于在根中的含量。经200mMNaCl处理21天后,叶和根中的化合物含量和分布发生了明显的变化:叶中化合物1、3、6和7的含量相对于盐处理前减少,其中化合物1、3和7差异显著,与此同时化合物2、5、8、9、10和11含量增加,其中化合物2、5、8、10和11差异显著:根中化合物1、2、3、4、5、8和11的含量相对于盐处理前减少,其中化合物1、2、3、4、5和8差异显著,与此同时化合物7和9含量增加,并且差异显著;盐处理后化合物1、7和9的含量在根中相对于叶中的比例有所增加,化合物2、3、5、8和10的含量在根中相对于叶中有所下降;杨梅苷类成分(8, 9, 11)在盐处理前后变化显著。结论认为,NaCl胁迫影响了二色补血草不同组织内黄酮和酚酸类化学成分含量的变化和其在植物体内的重新分配,其中杨梅苷类化合物变化显著,推测它们可能在二色补血草受到盐胁迫时在抗氧化防御系统中发挥了作用。4盐胁迫对查尔酮合成酶基因(CHHS)表达的影响黄酮类成分是二色补血草的主要药用成分之一,也可能是其抗盐体系中的非酶类抗氧化剂。为了验证黄酮类化合物合成关键酶查尔酮合成酶基因(CHS)在盐处理前后在二色补血草中的表达情况,本研究提取二色补血草盐处理前后的总RNA,克隆获得了 CHS基因片段,并进行了相对定量表达分析。研究结果显示,经过200 mMNaCl处理48h后,叶片中CHS基因的表达相比于对照组明显上调,而在根中CHS基因的表达相比于对照组下调,表明盐胁迫引起了二色补血草CHS基因表达的变化。该结果与二色补血草盐胁迫前后化学成分变化的研究结果基本吻合。