转基因水稻的研发技术日益成熟,越来越多的转化体获得不同国家的安全许可或进入田间试验,但作为重要主粮,其产业化及安全性问题引起社会广泛关注,近年来,有关转基因水稻的突发事件时有发生,引起了不必要的贸易摩擦和民众恐慌,国内外都高度重视转基因水稻的安全评价与监管检测工作。因此,加强转基因水稻检测方法与标准物质的研究,提升监管能力水平十分必要。本研究首先针对基于硅基质膜柱的基因组DNA提取方法进行优化,开发了新型植物种子基因组DNA提取试剂盒,同时对水稻种子研磨粒度与基因组DNA提取质量之间关系进行分析,提高基因组DNA质量和得率,为下一步PCR检测提供基础;其次对已发现的和本研究开发的水稻内标准基因,以及反应体系与程序进行优化筛选、深入研究,研制了水稻内标准基因检测方法标准;再次对转基因水稻的筛选元件进行统计分析,建立了转基因水稻筛查检测方法,构建了检测用阳性标准质粒;最后成功研制了转基因抗虫水稻克螟稻基因组DNA标准物质,为检测提供物质基础。这些结果为我国转基因水稻安全评价与管理、标识制度的实施,以及监管检测提供了数据基础和技术支撑。本研究我们取得的主要成果如下:1.研发了一种新型植物种子DNA提取试剂盒。基于核酸的PCR技术是转基因检测最稳定、可靠、高效的方法,而获取高质量的基因组DNA是保证检测结果的重要基础,各生物公司也相继开发了多种DNA提取的试剂盒,但在实际应用中,存在提取质量和得率不高以及成本较高的问题,本研究基于硅基质膜柱的方法,通过对过柱缓冲液的pH值和盐浓度的优化,研发一种植物种子DNA提取试剂盒,与市售业内评价较高的试剂盒相比,在基因组DNA提取质量和得率上都有显著提高,并针对水稻种子研磨粒度对基因组DNA提取效率开展研究,为下一步PCR检测提供了基础;2.研制了转基因水稻内标准基因检测的国家标准。国内外相继建立了多种转基因水稻转化体特异性检测方法,但由于不同内标准基因的使用,影响了检测结果间的可比性。本研究以国内外标准、文献中已发表的水稻内标准基因,以及通过本研究筛选的新水稻内标准基因为对象,设计引物及探针,比较不同内标准基因在不同水稻品种中的差异性和检测的灵敏度,进行深入的分析和比较,筛选出具有较好的种间特异性、种内一致性、拷贝数稳定,以及灵敏度较高的水稻内标准基因,并对其PCR扩增检测相关的反应程序和反应体系进行优化,建立标准化水稻内标准基因的普通PCR及实时荧光PCR定性检测方法,进一步为我国转基因水稻安全管理、标识制度的实施,以及转基因检测标准化提供技术支撑;3.建立了转基因水稻筛选检测方法,构建了阳性标准质粒。在转基因水稻日常检测中,各检测机构没有确定统一的检测参数,时而会出现相同样品在不同检测机构之间检测结果不同的现象,给客户及政府执法带来了不确定性,也给检测机构带来了不必要的纠纷。本研究收集、统计了国内外报导的转基因水稻外源元件,并分析这些元件的使用频率及覆盖率,进一步建立了转基因水稻的筛查检测方法,同时构建了筛查与特定转化体检测用阳性标准质粒,为转基因水稻的监管检测提供了统一标准;4.研制了转基因水稻克螟稻基因组DNA标准物质。转基因抗虫水稻克螟稻在我国已进入生产性试验研究阶段,国内外都非常关注,其检测方法及检测标准已相继发布,但至今尚未有检测用标准物质或标准品。本研究以克螟稻为基础材料,建立了克螟稻数字PCR检测方法,提取其基因组DNA,通过均匀性和稳定性测试,以数字PCR方法通过8家实验室联合定值,成功研制了克螟稻基因组DNA标准物质,填补了国内空白,也为水稻的监管检测提供重要的物质基础。