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猪肠粘膜蛋白是一种营养性动物蛋白质原料,由猪肠粘膜水解制得,不仅富含蛋白质、脂肪、纤维和钙等矿物质元素,还有多种氨基酸、多肽类和核苷酸类物质,如果随污水直接排放,会造成大量的蛋白质资源浪费和环境污染。利用天然肠衣加工副产物肠粘膜制备活性多肽,提高动物副产物的再生利用价值,不仅可以实现动物副产物资源的循环利用,提升蛋白质资源的利用率,又可以从源头减少环境污染,促进天然肠衣的可持续发展。本文以天然猪肠衣加工副产物肠粘膜为原料,通过酶解技术制备肠粘膜多肽,利用体外化学方法和体内动物模型综合评价肠粘膜多肽的抗氧化活性。采用超滤和凝胶过滤色谱分离技术对肠粘膜多肽进行逐级纯化,并采用毛细管高效液相色谱联用Q-Exactive质谱对目标肽进行氨基酸序列的鉴定。主要研究结果如下:1、肠粘膜粗蛋白含量为57.14%,含有17种游离氨基酸,其中主要的抗氧化氨基酸(Tyr、Met、His、Cys、Phe)含量为15.22%,这些氨基酸是肠粘膜具有抗氧化活性的重要物质基础。选择木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶水解肠粘膜,以水解度为评价标准,结果表明木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解效果显著优于胃蛋白酶水解效果(P<0.05)。通过单因素实验和响应面法优化肠粘膜酶解工艺条件,得出木瓜蛋白酶最佳条件为:酶加量4500U/g,水解时间6.6h,水解温度47℃,料液比1:5,最终得到的多肽含量为50.17%;胰蛋白酶最佳条件为:酶加量4800U/g,水解时间7.2h,水解温度54℃,料液比1:5,最终得到的多肽含量为45.25%,两种蛋白酶实际值与模型预测值均无显著性差异(P>0.05)。2、采用4种体外化学方法和体内动物模型综合评价肠粘膜多肽的抗氧化活性。体外抗氧化研究结果表明肠粘膜多肽具有清除DPPH自由基能力、还原力、螯合金属离子能力和抑制脂质过氧化能力,木瓜蛋白酶水解得到的肠粘膜多肽表现出更好的体外抗氧化活性。建立饲喂木瓜蛋白酶制备得到的肠粘膜多肽对D-半乳糖诱导的小鼠亚急性衰老模型,设置衰老模型组和阳性对照组与肠粘膜多肽处理组比较,结果显示注射D-半乳糖的小鼠心脏、肝脏、血清的 MDA 含量分别为 60.10 nmol/mg 蛋白、107.24 nmol/mg 蛋白、46.59 nmol/mL血清显著高于其他各组(P<0.05),并且降低了机体抗氧化酶的活性,证明此衰老模型的有效性。衰老模型组小鼠体内的抗氧化酶活力显著低于空白对照组,多肽处理组小鼠体内的抗氧化酶活力显著高于空白对照组(P<0.05),同时MDA含量显著低于空白对照组(P<0.05),说明木瓜蛋白酶制备得到的肠粘膜多肽具有体内抗氧化活性。体外实验和体内实验充分证明肠粘膜多肽具有抗氧化活性。3、采用超滤、凝胶过滤色谱和毛细管高效液相色谱一系列分离技术对肠粘膜多肽进行了分离纯化。超滤法将肠粘膜多肽分离成分子量不同的两个组分:RSH-I(MW>3.0kDa)、RSH-II(MW<3.0kDa),其中分子量小于3.0kDa的肠粘膜多肽抗氧化活性显著高于(P<0.05)分子量大于3.0kDa的肠粘膜多肽抗氧化活性。将组分RSH-II经葡聚糖G-25凝胶层析后,得到了组分A1和A2,其中分子量较小的A2组表现出更好的抗氧化活性。通过毛细管高效液相色谱串联Q-Exactive MS对肠粘膜抗氧化肽进行结构鉴定,得到目标肽的两个氨基酸序列分别为Asp-Gly-Leu-Lys-His-Leu-Asp-Asn-Leu1-Lys(1152.64 Da)和Asn-Asp-Trp-Glu-Asp-His-Leu-Ala-Val-Lys(1226.58 Da)。纯化肽和合成肽的抗氧化活性不存在显著性差异(P>0.05),证明 Asp-Gly-Leu-Lys-His-Leu-Asp-Asn-Leu-Lys 和 Asn-Asp-Trp-Glu-Asp-His-Leu-Ala-Val-Lys是肠粘膜中主要的抗氧化肽。