禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)引起的可感染各种家禽和野生鸟类的一种感染和疾病综合征。禽流感病毒的血清亚型多而复杂,同一血清亚型内有不同的变异株,不同变异株对不同禽类的致病性又有很大差异。根据AIV的致病性,将其分为低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza, LPAI)和高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza, HPAI)。在危害级别上,HPAI是我国的一类动物疫病(《动物防疫法》),OIE法定报告的动物疫病。我国主要采取强制免疫和扑杀相结合的防控策略防控禽流感。目前国内所使用的疫苗主要有重组禽流感H5亚型二价灭活疫苗(H5N1亚型Re5+Re4株)、重组禽流感H5亚型灭活疫苗(H5N1亚型Re5株)和重组禽流感H5亚型灭活疫苗(H5N1亚型Re4株)。AIV抗原变异快,容易产生新亚型或新的变异株,国内目前流行的AIV变异情况如何,有无新的变异株出现等,是兽医界和养殖业界关注的重点之一；由于对AIVHA基因测序及同源性分析技术可以不涉及活毒,技术成熟,而且检测所需时间相对较短,深受广大研究者重视,但AIV HA基因的序列变异与免疫保护有无相关性,有无其它更好的方法判定所用疫苗对流行毒株的免疫保护效果,以及所使用的疫苗能否对目前流行的AIV提供有效的保护,是迫切需要解决的问题之二；有了好的疫苗,如何免疫才能达到良好的免疫效果,也是实际生产中需要解决的主要问题。因此开展此项H5N1亚型AIV HA基因序列变异与免疫保护相关性分析及灭活疫苗免疫程序制定及应用工作,以期为解决上述三大问题及国内目前禽流感防控措施的制定提供试验依据。一、H5NI亚型禽流感病毒HA基因序列测定及分析用国内外通用的方法对2005～2010年分离自国内不同地区和宿主的39株H5N1亚型AIV的HA基因进行测序并分析各毒株之间的同源性,结合中国动物卫生与流行病学中心及哈尔滨兽医研究所对近年来分离的627株H5N1亚型AIV的来源及HA基因进行测序情况,对666株国内近年来分离的H5N1亚型AIV分布及HA基因变异情况进行分析。结果表明,目前国内H5N1亚型禽流感病毒的流行比较普遍,分离毒的分布情况与当地的气候及养殖数量基本一致,华南、华东和西南地区最多,其次华中和华北地区,东北和西北地区相对较少。H5N1亚型AIV在国内的宿主范围十分广泛,包括鸭、鸡、鹅、野鸟、鸽子和被污染的饲料或垫料及水源等,几乎涵盖了所有的野生及家养禽类。从分离时间上看,分离毒株有逐年增多的趋势。从H5N1亚型禽流感病毒HA基因序列差异上可将H5N1亚型禽流感病毒分为多个大的分支,每个分支中又可分为若干个细的分支。666株H5N1亚型AIV中,2.3.2分支共有395株,占分离毒的59.3%,为国内目前H5N1亚型AIV的主要流行分支；2.3.4分支共有160株,占分离毒的24%,该分支是国内2006～2008年之间的主要流行分支,2009年开始下降,但2010年以来,该分支又在国内多省市发现,而且毒株间又有了较大的变异；7.2分支共有66株,约占分离毒的10%,主要在河南、河北、山西等地呈区域性流行。对2008年以前分离的毒株和2009年以后分离的毒株进行同源性比较发现,同一分支之间的同源性较高,不同分支之间的同源性较低；同一分支中,新毒和新毒之间的同源性较高,旧毒和旧毒之间的同源性较高,新毒和旧毒之间的同源性较低；不同分支中,新毒和新毒之间的同源性较高,旧毒和旧毒之间的同源性较高,新毒和旧毒之间的同源性较低。表明病毒的变异很快而且很大,应引起高度重视。二、H5N1亚型AIV HA基因序列变异与血凝抑制效价、中和效价及疫苗免疫保护相关性分析用根据对39株H5N1亚型AIV的HA基因进化树的分析和对基因阅读框内核苷酸序列同源性的比较结果,从中选出的10株流行毒(2.3.2.b、2.3.2.c、2.3.4.a、2.3.2.b分支及7.2分支中各2株)和用重组技术重组的4株重组病毒(分别为2.3.2.b、2.3.2.c、2.3.4.a及7.2分)共14株病毒,分别制备灭活疫苗及单因子血清,进行交叉血凝抑制试验和交叉中和试验;用制备的灭活疫苗分别免疫SPF鸡,21天后,再分别用选取的10株分离毒进行交叉攻毒保护试验。试验结果表明,H5N1亚型禽流感病毒病毒的HA基因的变异情况、病毒的血凝效价、中和效价与攻毒保护率四者之间呈正相关。病毒HA基因的同源性越高,交叉血凝抑制作用(HI效价)相差越小,中和作用(中和指数)相差越小,交叉保护作用越好,反之亦然。分支内各毒株之间的HA基因核苷酸序同源性在95%以上,交叉HI效价相差0～3个滴度,中和效价相差1～2个滴度,疫苗免疫后交叉攻毒保护9/10以上。但各分支之间的相关性较差,分支之间各毒株的HA基因核苷酸序同源性在90.1%～96.9%之间,交叉HI效价相差3～6个滴度,中和效价相差2～5个滴度,疫苗免疫后交叉攻毒保护只有40%～60%,部分抗体滴度为24～27的鸡攻毒后仍然表现出典型的临床症状或死亡。目前国内使用的Re5株(属于2.3.4.a分支)和/或Re4株(属于7.2分支)重组禽流感病毒灭活疫苗对2.3.2分支病毒的攻毒保护率只有40%～60%之间,而由中国动物卫生与流行病学中心研制的PCPR-2株重组禽流感病毒灭活疫苗(制苗毒株为2.3.2分支中CK/SD/01/10株病毒的重组株)对2.3.2分支病毒的攻毒保护率达到90%以上,证明目前国内使用的疫苗株与当前主要流行毒株不相匹配,已不符合实际防控需要,急需研发和推广与当前主要流行毒株相匹配新疫苗。由于血凝抑制试验、病毒中和试验和攻毒保护试验都涉及到活毒,从生物安全方面考虑,在普通试验条件下不宜进行,而病毒HA基因序列检测和分析所涉及的生物安全风险相对要小一点,而且所需时间也相对较短,因此在实际研究中可先进行病毒HA基因测序分析,必要时再进行血凝抑制试验、病毒中和试验和攻毒保护试验研究。用分离毒制备的灭活疫苗免疫后对同一分支不同分离毒的攻击保护率均在90%以上,免疫鸡攻毒后均无典型临床症状,对不同分支分离毒的攻击也有一定的保护作用,保护率为70%～90%,多数免疫鸡攻毒后无临床症状,抗体低于2‘的鸡才表现出典型的临床症状或死亡；用重组毒株制备的灭活疫苗免疫后,虽然免疫抗体相对较高,均在26以上,但对分离毒的保护率相对较低,对同一分支不同分离毒的攻击保护率在80%以上,免疫鸡攻毒后均无典型临床症状,而对不同分支的分离毒的保护率只有40%～60%,部分2‘～28的鸡攻毒后仍然表现出典型的临床症状或带毒。这一结果表明,重组毒株的免疫原性比流行毒株的免疫原性要差一些。但是,由于流行毒株多数为强毒,直接用流行毒株制备灭活疫苗可能会存在一定的生物安全风险,OIE和各国政府都禁止使用流行的强毒株制备灭活疫苗,建议用同亚型的弱毒株或重组弱毒株制备的灭活疫苗进行免疫。为克服重组弱毒株疫苗免疫保护作用相对较差的缺陷,建议在实际生产中,通过提高重组疫苗中抗原含量、增加免疫次数方法,使禽体内的抗体始终保持在一相对较高的水平,从而降低禽群发病风险。三、重组禽流感H5亚型二价灭活疫苗(H5N1亚型Re5+Re4株)免疫程序制定及应用用同一批重组禽流感H5亚型二价灭活疫苗(H5N1亚型Re5+Re4株)免疫SPF鸡、不同环境及饲养管理条件下的商品蛋鸡、肉种鸡及商品肉鸡,免疫后连续检测Re5及Re4抗体,分析比较其免疫后的抗体消长规律,制定免疫程序并在实际生产中试用。检测结果表明,疫苗免疫后的最高抗体滴度及高峰抗体滴度(26以上)维持时间与免疫剂量有关。免疫剂量为0.1mL/只时,免疫后Re5的最高滴度为28.3,高峰抗体滴度可维持到40周以后；免疫剂量为0.2mL/只时,免疫后Re5的最高滴度为29.0,高峰抗体滴度可维持到50周以后；免疫剂量为0.3mL/只时,免疫后Re5的最高滴度为29.5,高峰抗体滴度可维持到60周以后。鸡群免疫后的抗体滴度及高峰滴度抗体维持时间与饲养管理条件及所处环境的污染程度密切相关,鸡群在良好的饲养管理条件下,免疫后的抗体滴度高且高峰抗体滴度维持时间长,反之,抗体滴度低且维持时间短。商品肉鸡的免疫效果相对较差,可能与育种有关。母源抗体对二价苗的免疫效果也有一定的影响,有母源抗体的雏鸡免疫后,抗体先降(与对照相比)后升,母源抗体越高,抗体上升越慢。Re4的抗体滴度比Re5高0.4以上。根据研究结果制定如下免疫程序：商品肉鸡群,如28天以前出栏,不免疫(但应选用母源抗体6Log2以上的雏鸡),如35天以后出栏,在1周龄内进行免疫,0.4mL/只；商品蛋鸡和种鸡,如所处环境污染不重,饲养管理较好,在1～2周龄首免,6～7周龄二免,开产前2周三免疫,首免时0.2一0.3mL/只,二免和三免时0.5mL/只,如所处环境污染严重,在1～2周龄首免,6～7周龄二免,开产前2周三免,以后每隔10～15周免疫一次,首免时0.2～0.3mL/只,而后是0.5mL/只；肉种鸡的体型较大,开产较晚,免疫剂量应适当加大,为保证雏鸡有较高的母源抗体,在2周龄左右免疫0.5毫升/只,12、20、30、40、50周龄前后时免疫0.8mL/只/次。自2009年开始,青岛易邦生物工程有限公司将此免疫程序作为所生产该疫苗的建议免疫程序在全国各地使用40多亿羽份,应用结果表明,该免疫程序符合临床实际,具有可操作性,免疫效果确实,深受广大用户欢迎。