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生命活动是由各种生物活性物质参与,相互关联、相互制约的众多化学反应的总结果。许多生物活性物质与氨基酸、蛋白质或其它有机基团结合,发挥各种各样的生物学作用、特殊的生理功能和高度的生化效应。其中,氢离子和活性氧自由基是两种重要的生物活性物质。氢离子浓度作为一个重要的新陈代谢及细胞内的参数,在许多细胞内的过程中起到关键的调节作用。许多报道认为一些疾病与细胞质或者酸性细胞器内的pH异常有关。因此,精确测量细胞内的pH非常重要。目前,许多方法可用于检测pH.这些方法包括微电极、核磁及荧光光谱方法。其中,荧光法由于其非破坏性、高的灵敏度和专一性、以及广泛可用的荧光染料在测定pH时比其他方法更具优越性。而且,荧光显微成像技术通过使用荧光pH探针能够描绘出活体细胞内氢离子的时空分辨。目前,两类荧光pH探针得到开发应用:一类是用于检测pH范围大约是6.8-7.4的细胞质内pH的探针;另一类是用于检测酸性器官如溶酶体、内涵体等的探针,这些酸性器官pH范围大约是4.5-6.0.由于细胞内pH的微小变化可能导致细胞的功能紊乱,因此理想的pH荧光探针应当灵敏的响应细胞内pH的微小变化,并且能够避免来自生物细胞本身的干扰。然而,目前可用的pH荧光探针有以下缺点:低的灵敏度,有的激发在紫外区。激发在紫外区会损伤活体样品并且引起细胞内生物分子自发荧光的干扰。另外,用于检测酸性器官内的尤其是理想的pH探针几乎没有,这被认为是细胞生物学及医学发展的瓶颈。因此,我们研究的焦点在于设计具有好的选择性、高的灵敏度、好的光稳定性以及工作pH在酸性范围的近红外pH荧光探针。另外,在生物的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基（ROS）,如超氧阴离子自由基（O2-·）、羟基自由基（HO·）、过氧化氢（H2O2）、一氧化氮（NO）、过氧亚硝基（ONOO-）等,这些自由基在生理学上起重要作用。在氧化胁迫下细胞内氧化水平的快速升高能够引起生物分子的损伤,导致各种疾病,比如癌症、机体炎症、组织过氧化、蛋白质交联变性、DNA损伤等。目前测定自由基的方法主要有电子自旋共振法（ESR）或电子顺磁共振法（EPR）、高效液相色谱法（HPLC）、化学发光法（CL）、荧光法以及电化学方法等。然而,由于生物体内活性氧自由基的半衰期非常短,稳态浓度极低,所以真正适用于检测生物活体内ROS的方法还是较少的。目前,荧光成像方法具有好的灵敏度、选择性,并且充分利用了共聚焦激光扫描显微镜方法（CLSM）的优点。CLSM是一种具有高分辨率的荧光显微成像方法,它能够给出探针所检测自由基在细胞及组织的荧光成像。荧光成像方法挑战了传统的荧光方法,实现了自由基的“实时、可视、定量”检测。目前迫切需要科研工作者开发对ROS能够专一识别、快速响应的荧光探针用以动态观测研究某些器官中活性氧自由基的产生、代谢、相互转化及其动态损伤生物机体的过程。本论文主要以提高探针的响应速度、灵敏度以及选择性为主要出发点,以荧光检测和共聚焦显微成像技术为研究手段,基于氢离子、超氧阴离子自由基分别引起探针荧光变化的机理,开展了两方面的工作。（一）以三碳花菁和3-氨基苯酚为原料设计合成了一个双重的近红外pH荧光探针AP-Cy. AP-Cy具有高的灵敏度,好的光稳定性,优越的细胞膜穿透性以及强的pH依赖。pH滴定实验表明酸性条件下在4.0-6.5 pH范围荧光强度增强10倍有余,pKa为5.14.在碱性条件下,工作pH范围是10.5-11.8,pKa为11.31.探针用于HepG2细胞的荧光成像结果进一步表明了该探针在监测活体细胞内H+潜在的重要价值。（二）以荧光素和三苯基溴化锗为原料,设计合成了用于检测超氧阴离子自由基的荧光探针。该探针能够快速响应超氧自由基,并且具有较好的选择性、灵敏度及光稳定性。另外,作为一种有机锗化物,该探针毒性很低甚至无毒,能够很好的用于生物体系。