多花黄精的多糖提取、纯化、结构解析及活性研究

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背景:多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)为百合科(Liliaceae)黄精属(polygonatum Mill.)植物,是一种常见的药食同源植物,与黄精(Polygonatum sibiricum Red)和滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.一起作为黄精的基源植物收载在2015年版《中国药典》(一部)中。目的:经作者检索,目前对多花黄精多糖的研究较少,本课题以多花黄精的干燥根茎为原料,研究了多花黄精多糖的提取、分离纯化、结构解析、抗氧化活性及免疫调节活性,为后续多花黄精多糖的研究提供依据。方法与结果:研究主要围绕四个方面:粗多糖的提取条件的优化;粗多糖的分离纯化及结构解析;多糖的体外抗氧化活性研究;多糖的免疫调节活性研究。实验结果如下:1.粗多糖的提取条件的优化:使用Box-Beknken实验设计筛选超声辅助提取多花黄精多糖的最佳提取参数。分别探究了提取多糖的时间、提取多糖的温度、料液比、超声功率对提取率的影响,确定最佳的实验条件。运用Design Expert 10.0分析实验的数据,确定提取率最高的实验条件是:最佳温度是63.8℃、最佳时长是36.9 min、料液比是47.6 mL/g、超声功率是225 W,多花黄精多糖的最高提取率为24.61%。2.多糖的分离、纯化及结构解析:从多花黄精中制备的粗多糖通过以DEAE cellulose-52为填料的色谱柱,分离得到PCP-1、PCP-2和PCP-3三种组分,得率分别为55.3%,15.7%和8.1%。将主要组分PCP-1通过葡聚糖G-100凝胶为填料的色谱柱去除杂质。对PCP-1进行紫外分析,表明该组分不含蛋白质和核酸。对PCP-1采用红外光谱分析,在得到的图谱中明显具有多糖的几个标志性吸收峰。HPGPC法对PCP-1的出峰情况和相对分子量进行分析,从图谱中得知,PCP-1只有一个峰,且锋形对称,说明PCP-1组分均一,纯度高,其分子量为2966 Da。PCP-1的单糖组分测定通过PMP柱前衍生化法测定,液相图谱显示PCP-1由Man、Glc、Gal、Xyl和Ara五种单糖构成,其摩尔比为1:17.53:7.02:0.27:0.59。电镜扫描结果表明PCP-1主要由自由分布的不规则薄片组成。1 H NMR和13C NMR表明PCP-1主要含有β-型糖苷键,少量α-型糖苷键,并含有6种糖残基。3.多糖组分PCP-1的体外抗氧化研究:通过考察PCP-1对体外抗氧化活性有关指标的测定,发现与Vc相比,PCP-1具有的清除自由基的能力,在不同的体系清除能力不同,PCP-1对DPPH?和O2?的清除率较高,与Fe2+的螯合率较高,且在PCP-1的测试浓度范围(0-3 mg/mL)内存在一定的剂量效应,随着PCP-1浓度的增大,PCP-1的清除率也随之增高。4..多糖组分PCP-1的免疫调节研究:MTT法检测结果显示,PCP-1不会导致细胞凋亡或坏死的同时,还可以促进巨噬细胞RAW264.7的生长;中性红吞噬实验可知,PCP-1能显著提高巨噬细胞RAW264.7的细胞吞噬能力;通过测定NO的含量,发现PCP-1能促进巨噬细胞RAW264.7 NO的产生,PCP-1的浓度越大,巨噬细胞产生的NO越多。结论:通过本课题的研究,发现从多花黄精粗多糖中分离纯化得到的PCP-1具有良好的抗氧化活性和免疫调节活性,为开发天然抗氧化剂和免疫调节剂提供新思路与新线索。
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