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本研究结合当前猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)致病机制、疾病防控及病毒基因功能研究进展,以欧洲型PRRSV(RRSV-1)的ORF5编码蛋白为主要免疫原,利用Bac-to-Bac~?杆状病毒-昆虫细胞表达系统,采用4种不同的蛋白表达策略,包装制备由GP5和M蛋白组成的欧洲型PRRSV病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),并通过鼻腔黏膜免疫途径分析其免疫原性。首先以本实验室保存的欧洲型PRRSV LV株基因组为模板,通过RT-PCR方法获得PRRSV-1 GP5和M基因,利用生物信息学及相应软件分别对两种基因的遗传进化关系及其编码蛋白结构进行分析;同时从猪肺巨噬细胞中扩增获得猪IFN-λ1基因,并将其与PRRSV M基因融合,信号肽和跨膜区分析显示,IFN-λ1的融合可能不影响M蛋白表达。进而将GP5、M或pIFN-λ1基因分别克隆到杆状病毒穿梭载体pFast Bac HTA/C或pFastBac Dual中,采用热激法将重组穿梭质粒转化至DH10~?Bac大肠杆菌感受态细胞;使用蓝白斑筛选技术获得重组杆粒rB-GP5、rB-M、rB-pIFNλ1、rB-M-pIFNλ1或rBD-GP5-M;采用阳离子转染方法将重组杆粒转染至SF9细胞,拯救重组杆状病毒。重组杆状病毒扩大培养至第二代,采用酶联免疫斑点实验法测定重组杆状病毒滴度,同时利用Western Blot、间接免疫荧光等方法检测GP5和M蛋白的表达情况;然后设置病毒感染不同时间点检测GP5和M蛋白的表达情况,以确定病毒样颗粒的最佳收获时间;使用无血清表达系统大量制备PRRSV VLPs,收集细胞培养上清,采用蔗糖垫超速离心、蔗糖密度梯度离心策略进行纯化,Western blot鉴定GP5和M均存在后,利用透射电镜观察所收集的VLPs的形态;最后以小鼠为试验动物,通过鼻腔免疫策略及免疫后体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫指标的检测,分析VLPs的免疫原性,同时添加A5佐剂,并对VLPs-A5复合物的免疫原性进行了评价。结果显示,GP5和M蛋白共表达策略,即利用pFastBac Dual载体,构建重组杆粒rBD-GP5-M,包装并拯救同时携带PRRSV-1 GP5和M蛋白基因的重组杆状病毒rBDV-GP5-M,感染无血清悬浮培养的SF9细胞可以成功包装出具有PRRSV相似形态结构的VLPs。将纯化的VLPs作为免疫原,通过鼻腔免疫途径免疫小鼠,整个试验过程中小鼠的体重呈现稳定上升趋势,免疫过程没有引起小鼠过于强烈的应激反应;单独使用VLPs和VLPs+A5均能通过鼻腔免疫途径诱导小鼠局部sIgA分泌量增加,及全身性具有中和作用的IgG抗体水平升高;免疫应答类型是以B细胞免疫应答为主的体液免疫;A5递送系统能够让VLPs缓慢释放,使得机体的抗体水平保持在持续上升的状态,提供长期的免疫保护,表明PRRSV-1 VLPs具有开发成安全有效的新型黏膜疫苗的潜能,A5递送系统可增强粘膜免疫应答水平。