桉叶油拮抗维甲酸致畸作用的实验研究

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目的:用桉叶油和维甲酸灌胃SD孕鼠,研究桉叶油对维甲酸致畸形作用的影响。通过检测胎鼠脑组织中Pax3、Cx43及其mRNA的表达情况,对其机理进行初步探索。为桉叶油的药用开发提供一些实验依据。  方法:选出SD孕鼠42只,随机分为6组,每组7只,溶剂组(花生油+RA),3个实验组(桉叶油高、中、低剂量+RA),维甲酸组(RA)和正常组。溶剂对照组用花生油2 ml/只﹒d于孕第7-14 d灌胃,每天一次,孕第10天维甲酸40 mg/kg灌胃一次。桉叶油3个剂量组分别用300 mg/kg﹒d、200 mg/kg﹒d、100 mg/kg﹒d桉叶油于孕第7-14天灌胃,每天一次,孕第10天维甲酸40 mg/kg灌胃一次。RA组用40 mg/kg的维甲酸于孕第10天灌胃一次。正常组为自由饮食。各组于孕21天早上处死孕鼠取胚胎,记录孕鼠体重,子宫重和胎盘重。计胚胎植入总数,吸收胎数、活胎数、死胎数。观察胚胎外形,并测量胎鼠体重、身长、尾长。在孕鼠子宫紧邻阴道处,左右各获取1只胎鼠,取其中一只胎鼠脑组织固定,免疫组化技术检测胎鼠脑组织的Pax3、Cx43蛋白的表达。取另一只胎鼠脑组织提取蛋白和RNA,Western Blot、荧光定量PCR检测脑组织Pax3、Cx43蛋白及其mRNA表达。剩余活胎用阿利新蓝和茜素红进行骨骼染色,体视镜下观测椎骨发育,脊柱间隙。  结果:  1.维甲酸、桉叶油+RA和溶剂+RA对孕鼠的影响各组孕鼠未见明显的外观异常,被毛有光泽,活动佳,摄食正常,大便正常。正常对照组、桉叶油+RA各组和溶剂+RA组孕鼠增重、子宫重和胎盘重与RA组比较均无显著性差异;溶剂+RA组的孕鼠的胎盘重较正常对照组低,比较有显著性差异。  2.桉叶油对维甲酸干扰大鼠胚胎植入及生长发育的影响外观无畸形的活胎总体表现为体形完好,肤色红润,刺激运动反应良好。外观有畸形活胎个体较无外观畸形胎的体型小,畸形主要表现为脑膜膨出,脊柱裂、眼凸,短尾等。正常对照组的活胎率(97.3±4.6)%,较灌胃维甲酸各组的活胎率高,吸收胎率(2.6±4.6)%,和畸形率(0)较灌胃维甲酸各组的低,死胎率为0;在灌胃维甲酸各组中,桉叶油高(79.6±14.5)%,中(67.6±30.8)%剂量组的活胎率与 RA(58.6±26.6)%组比较有升高的趋势,但无显著性差异;畸胎率(44.5±41.6;57.5±35.1)%与 RA(68.1±43.6)%组比较有降低的趋势,但无显著性差异。灌胃维甲酸各组的吸收胎率比较无显著性差异。正常对照组的胎鼠体重、身长、尾长均值明显高于灌胃维甲酸各组胎鼠的体重、身长、尾长均值;在灌胃维甲酸各组中,桉叶油各组胎鼠体重、身长的均值明显高于RA组;溶剂对照组胎鼠体重、身长、尾长与RA组比较无显著性差异;桉叶油各组胎鼠尾长的均值与RA组比较有升高的趋势,但比较无显著性差异。  3.桉叶油对维甲酸诱发大鼠胚胎神经管畸形的影响灌胃维甲酸各组胎鼠椎骨数量异常的胎鼠数与正常对照组比较无显著性差异,但有椎骨形态异常数或者椎骨分裂的胎鼠数较正常对照组高。在灌胃维甲酸各组中,桉叶油各组椎骨形态异常数或者椎骨分裂的胎鼠数较维甲酸组和溶剂对照组的低。与单纯灌胃维甲酸组比较,正常组胎鼠大脑组织的Pax3、Cx43蛋白及其mRNA的表达较RA组低,在灌胃维甲酸各组中,灌胃桉叶油各组胎鼠脑组织Pax3、Cx43蛋白及其mRNA的表达较单纯灌胃RA组低,且比较有显著性差异。  结论:  1.维甲酸干扰了大鼠胚胎的植入和发育,桉叶油对维甲酸干扰大鼠胚胎植入有一定的拮抗作用,对维甲酸引起的胎鼠生长发育迟缓有一定的拮抗作用。  2.维甲酸引起胎鼠神经管缺陷的机理可能与其上调胎鼠神经组织的Pax3、Cx43蛋白过度表达有关。桉叶油对维甲酸引起胎鼠神经管缺陷有一定的拮抗作用。其机理可能与桉叶油拮抗维甲酸上调胎鼠神经组织的Pax3、Cx43蛋白过度表达有关。
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