【摘 要】
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目的探究天然生物材料蝶翅表面的微纳米结构对皮肤源性前体细胞（Skin-derived Precursors,SKPs）增殖和分化的影响,并仿生蝶翅表面结构形貌制备具有相似表面结构的壳聚糖膜材料,进一步探讨人工生物材料表面拓扑结构对SKPs的增殖以及向神经细胞（神经元和神经胶质细胞）分化的影响,为组织工程材料研发及其临床应用提供理论和实验依据。方法选用具有不同表面微纳米结构的大蓝闪蝶（Morpho
【基金项目】
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国家自然科学基金（31971276）
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目的探究天然生物材料蝶翅表面的微纳米结构对皮肤源性前体细胞（Skin-derived Precursors,SKPs）增殖和分化的影响,并仿生蝶翅表面结构形貌制备具有相似表面结构的壳聚糖膜材料,进一步探讨人工生物材料表面拓扑结构对SKPs的增殖以及向神经细胞（神经元和神经胶质细胞）分化的影响,为组织工程材料研发及其临床应用提供理论和实验依据。方法选用具有不同表面微纳米结构的大蓝闪蝶（Morpho Menelaus,M.m.）和天堂凤蝶（Papilio ulysses telegonus,P.u.t.）蝶翅,进行酸碱及无菌处理。分离新生Sprague-Dawley（SD）大鼠背部皮肤,采用胶原酶消化法分离SKPs,用无血清培养基进行SKPs的纯化和扩增培养;将传代后的SKPs与蝶翅材料共培养,通过EdU检测SKPs在蝶翅材料上的增殖,cck8检测细胞活力,结晶紫染色、光镜、荧光显微镜等观察检测细胞在材料上的增殖、粘附和形态;在文献报道的培养基成分基础上降低培养基血清（FBS）浓度,检测SKPs在蝶翅材料表面向神经细胞分化的情况。仿生大蓝闪蝶蝶翅表面结构形貌,采用软刻蚀弹性印章的方法,在壳聚糖膜表面构建不同尺寸（10μm、30μm、50μm）的沟槽状结构微图案,对壳聚糖膜进行无菌处理。将传代的SKPs与具有不同表面结构的壳聚糖膜材料共培养,EdU、cck8、结晶紫染色、光镜、荧光显微镜等观察检测SKPs在材料上的增殖、粘附和形态,检测细胞在材料上经诱导分化7d和21d后SKPs向神经细胞的分化情况。构建大鼠坐骨神经损伤模型,制备具有内表面结构-SKPs的复合神经导管移植物,修复大鼠坐骨神经10mm缺损,术后观察动物整体状态,术后4w取坐骨神经进行免疫荧光组织化学染色检测神经细胞及坐骨神经修复再生情况。结果1.分离纯化的SKPs呈球状悬浮生长,表达外胚层神经干细胞标志物Nestin,中胚层间质细胞标志物Vimentin、Fibronectin,毛囊真皮乳头真皮鞘标志物Versican。2.SKPs和蝶翅材料共培养,EdU、cck8、结晶紫染色结果显示,在两种蝶翅材料上,≥5%FBS血清含量的培养基条件下,SKPs均可粘附、增殖,在此结果基础上选择因子含量较少的5%FBS培养基条件进行后续实验。3.细胞免疫荧光化学染色结果显示,SKPs在向神经元诱导分化培养条件下培养7d后,细胞在两种蝶翅上均表达干细胞标志物Nestin,而不表达成熟神经元标志物NeuN;SKPs在无诱导因子分化培养条件下培养7d后,细胞在两种蝶翅上均表达干细胞标志物Nestin,同时也有13%左右的细胞表达神经胶质细胞标志物S100;4.仿生大蓝闪蝶蝶翅表面结构形貌,采用软刻蚀弹性印章的方法,制备获得表面具有不同尺寸（10μm、30μm、50μm）沟槽状结构微图案的壳聚糖膜材料。5.将SKPs分别与三种不同表面结构的壳聚糖膜共培养,以壳聚糖平膜为对照,EdU和结晶紫染色结果显示,SKPs均粘附和增殖情况良好。细胞免疫荧光化学染色结果显示,SKPs在向神经元诱导分化培养条件下培养7d后,细胞在不同表面结构的壳聚糖材料上均表达干细胞标志物Nestin,而不表达成熟神经元标志物NeuN;培养21d后,细胞不表达干细胞标志物Nestin,而有一定比例表达成熟的神经元标志物NeuN,其中10μm壳聚糖组比例最高,约为14%;SKPs在无诱导因子分化培养条件下培养7d后,细胞在不同表面结构的壳聚糖材料上均表达干细胞标志物Nestin、神经胶质细胞标志物S100,而不表达成熟神经元标志物NeuN,培养21d后,所有组细胞不表达干细胞标志物Nestin,且均有一定比例表达神经胶质细胞标志物S100,其中10μm壳聚糖组表达的比例最高,约为12%,并且仅有10μm壳聚糖组表达成熟神经元标志物NeuN,比例约为11%。以上结果差异均具有统计学意义（P＜0.05）。6.制备获得具有内表面结构-SKPs的复合神经导管移植物,移植修复大鼠坐骨神经缺损,术后4w取坐骨神经进行抗NF200、S100免疫荧光组织化学染色,发现10μm壳聚糖组桥接处神经细胞样细胞密集,抗NF200、S100免疫荧光强度均高于壳聚糖平膜对照组。以上结果差异均具有统计学意义（P＜0.05）结论SKPs在具有表面微纳米结构的天然蝶翅及壳聚糖膜人工材料上均能黏附、增殖和分化。10μm条纹壳聚糖膜具有较好的诱导SKPs向神经细胞样细胞分化的效应。复合SKPs-具有内表面结构神经导管移植物可以修复大鼠坐骨神经缺损。
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