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骨骼,作为动物体内的重要组织器官,具有支撑身体、运动等作用,并参与机体复杂环境的调控。在正常骨骼,骨形成与骨吸收是骨重塑过程中的紧密耦合过程。破骨细胞(osteoclast)主要负责骨吸收,其数量增加或活性增强超过骨形成的速率,可导致骨量减少,引起骨质疏松症(osteoporosis)。目前,调控破骨细胞分化和功能的因素较多,且较复杂,已被广泛认知的关键调控中心轴是“骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/核因子 κB 受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)/核因子 κB 受体活化因子(receptor activator of nuclear factor kappa-B,RANK)”。其中,RANKL可结合破骨细胞及其前体细胞膜上的RANK受体,促进破骨细胞分化,而OPG作为RANKL的诱饵受体,能够阻断RANKL与RANK的结合,间接抑制破骨细胞的分化及功能。在破骨细胞分化中,涉及单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)活化蛋白激酶(activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/核糖体蛋白 S6 激酶 1(ribosomal protein S6 kinase beta 1,S6K1,也称为p70S6K)信号通路介导的自噬,通过增加自噬标志蛋白的表达和自噬小体的数量,为其存活及功能发挥提供支持。本文旨在体外利用RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)诱导小鼠来源的骨髓单核细胞/巨噬细胞(bone marrow monocytes/macrophages,BMMs)和小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞形成破骨细胞,探讨AMPK/mTOR/p70S6K信号通路介导的自噬在OPG抑制破骨细胞分化中的作用机制。1.AICAR激活自噬对破骨细胞分化中的影响为探讨AMPK激活剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide,AICAR)对破骨细胞分化中自噬的影响,利用 RANKL(60 ng/mL)和 M-CSF(30 ng/mL)诱导 BMMs 和 RAW264.7 细胞 3.5 d,添加不同浓度AICAR(0、0.05、0.5和5 mM)继续孵育3 h,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色检测TRAP 阳性破骨细胞的形成,Western Blot检测组织蛋白酶 K(cathepsin K,CTSK)、c-Fos、活化 T 细胞的核因子胞质 1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)、Beclin1、微管相关蛋白 1A/1B 轻链 3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3)、p62(也称为SQSTM1/sequestomel)、p-mTOR/mTOR 及 AMPK 信号通路蛋白的表达,转染 EGFP-pmCherry-LC3质粒,激光共聚焦显微镜观察LC3聚点的变化。结果显示,AICAR可显著抑制TRAP阳性破骨细胞的形成,显著降低CTSK、c-Fos、NFATc1、p62、p-mTOR/mTOR、Ras 同源物(Rashomologue in the brain,Rheb)及 p-p70S6K/p70S6K 的表达(P<0.05 或 P<0.01),增加 LC3 聚点,显著上调 Beclin1、LC3 Ⅱ、p-AMPKα/AMPKα及结节性硬化复合物 2(tuberous sclerosis complex 2,TSC2)的表达(P<0.05 或 P<0.01)。表明激活AMPK可通过增加自噬及调控下游信号通路分子的表达,进而减弱破骨细胞分化。2.OPG通过AMPK信号通路抑制破骨细胞分化为探讨OPG抑制破骨细胞分化中是否激活AMPK信号通路,在破骨细胞培养过程中添加OPG(40 ng/mL)处理不同时间(0、1.5、3和6 h),或添加不同浓度OPG(0、20、40和80 ng/mL)处理3 h,TRAP染色检测TRAP阳性破骨细胞的形成,Western Blot检测CTSK、c-Fos、NFATc1、Beclin1、LC3Ⅱ、p62、自噬相关基因(autophagy-related genes,Atgs)、mTORC1及AMPK信号通路蛋白的表达,流式细胞术检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的变化,转染 EGFP-pmCherry-LC3 质粒,激光共聚焦显微镜观察LC3聚点的变化,透射电镜观察自噬小体及自噬溶酶体的变化。结果显示,OPG(40 ng/mL)处理 3 h 时,Beclin1 和 LC3 Ⅱ 的表达最高(P<0.01),p62的表达最低(P<0.01);不同浓度OPG均可抑制TRAP阳性破骨细胞的形成,显著降低 CTSK、c-Fos、NFATc1、p62、p-mTOR/mTOR、mTOR 调节相关蛋白(regulatory-associated protein of mTOR,Raptor)、Rheb 及 p-p70S6K/p70S6K 的表达(_P<0.05 或P<0.01),增加LC3聚点和自噬小体及自噬小体的数量,显著上调Beclin1、LC3 Ⅱ、p-AMPKα/AMPKα 及结节性硬化复合物 2(tuberous sclerosis complex 2,TSC2)的表达(P<0.05或P<0.01),而对ROS 水平的变化及G蛋白β亚基样蛋白(G protein beta subunit-like,GβL)的表达无影响。表明OPG可通过增加自噬及AMPK信号通路的表达抑制破骨细胞分化。3.自噬调控OPG抑制破骨细胞分化为探讨自噬对OPG抑制破骨细胞分化的作用,使用溶酶体抑制剂10 μmol/L 氯喹(chloroquine,CQ)和mTOR抑制剂5 μmol/L雷帕霉素分别预处理0.5 h和1 h后,添加OPG(40 ng/mL)处理3 h,TRAP染色检测TRAP阳性破骨细胞的形成,Western Blot检测c-Fos、NFATc1、Beclin1、p62及AMPK信号通路蛋白的表达,激光共聚焦显微镜观察LC3聚点的变化。结果显示,添加氯喹(CQ)和雷帕霉素(Rap)可显著减少TRAP阳性破骨细胞的数量(P<0.05或P<0.01),增加LC3聚点的数量;与氯喹(CQ)组相比,氯喹(CQ)+OPG组显著降低c-Fos的表达(P<0.01),显著上调p62、Rheb 及 p-p70S6K/p70S6K 的表达(P<0.05 或 P<0.01),对 p-AMPKα/AMPKα 和 TSC2的表达无影响;与雷帕霉素(Rap)组相比,雷帕霉素(Rap)+OPG组显著降低c-Fos、p62、Rheb 及 p-p70S6K/p70S6K 的表达(P<0.05 或 P<0.01),显著上调 Beclinl、p-AMPKα/AMPKα及TSC2的表达(P<0.05或P<0.01)。表明自噬调控OPG抑制破骨细胞分化中AMPK/mTOR/p70S6K信号通路。4.3-MA对OPG抑制破骨细胞分化中自噬的影响为探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对OPG抑制破骨细胞分化中自噬的影响,使用3-MA(5μmol/L)预处理0.5 h后,添加OPG(40 ng/mL)处理3 h,TRAP染色检测TRAP 阳性破骨细胞的形成,Western Blot检测CTSK、c-Fos、NFATc1、Beclinl、LC3 Ⅱ、p62、Atgs、mTORC1 及 AMPK 信号通路蛋白的表达,转染EGFP-pmCherry-LC3质粒,激光共聚焦显微镜观察LC3聚点的变化,透射电镜观察自噬小体及自噬溶酶体的变化。结果显示,与OPG组相比,3-MA+OPG组可增加TRAP阳性破骨细胞的分化,但显著降低CTSK、c-Fos、NFATc1、Beclin1、Atg5、Atg12、p-AMPKα/AMPKα 及 TSC2 的表达(P<0.05 或 P<0.01),显著上调 LC3 Ⅱ、Atg7、mTORC1、Rheb 及 p-p70S6K/p70S6K 的表达(P<0.05 或 P<0.01),增加 LC3 聚点,减少自噬小体及自噬溶酶体的数量。表明3-MA能够抑制OPG抑制破骨细胞分化中自噬,并可通过AMPK/mTOR/p70S6K信号通路产生作用。5.BAF对OPG抑制破骨细胞分化中自噬的影响为探讨巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1,BAF)对OPG抑制破骨细胞分化中自噬的影响,使用BAF(0.1 μmol/L)预处理0.5 h后,添加OPG(40 ng/mL)处理3 h,TRAP染色检测TRAP 阳性破骨细胞的形成,Western Blot检测CTSK、c-Fos、NFATc1、Beclin1、LC3Ⅱ、p62、Atgs、mTORC1 及 AMPK 信号通路蛋白的表达,转染 EGFP-pmCherry-LC3质粒,激光共聚焦显微镜观察LC3聚点的变化。结果显示,与OPG组相比,BAF+OPG 组可显著增加 CTSK、c-Fos、NFATc1、LC3 Ⅱ、p62、p-mTOR/mTOR、Raptor、Rheb 及 p-p70S6K/p70S6K 的表达(P<0.05 或P<0.01),显著下调 Beclin1、Atg5、Atg7 及 Atg12 的表达(P<0.01),但对 GβL、p-AMPKα/AMPKα 及 TSC2 的表达无影响,增加LC3聚点。表明BAF在OPG抑制破骨细胞分化中负反馈调节自噬,并通过mTOR及p70S6K的磷酸化抑制自噬。6.AMPK介导的自噬对OPG抑制破骨细胞分化的影响为探讨AMPK介导的自噬在OPG抑制破骨细胞分化中的作用,利用AMPK抑制剂Compound C(Com C)和靶向AMPK的siRNA处理破骨细胞,使用不同浓度的Com C(0、1.25、2.5、5 和 10μmol/L)或 AMPK α1/2siRNA(20nmol/L),添加 OPG(40 ng/mL)处理3 h,RTCA监测破骨细胞分化中形态动力学的变化,TRAP染色检测TRAP阳性破骨细胞的形成,Western Blot 检测 CTSK、c-Fos、NFATc1、Beclin1、LC3 Ⅱ、p62、Atgs、mTORC1及AMPK信号通路蛋白的表达,转染EGFP-pmCherry-LC3质粒,激光共聚焦显微镜观察LC3聚点的变化。结果显示,10 μmol/L Com C组下降了细胞指数(cellindex),1.25 μmol/L Com C组可显著增加TRAP阳性破骨细胞的数量(P<0.01);Com C(1.25 μmol/L)+OPG组和siAMPK+OPG组增加破骨细胞的数量,显著上调CTSK、c-Fos、LC3 Ⅱp62、p-mTOR/TOR、Raptor、Rheb 和 p-p70S6K/p70S6K 的表达(P<0.05 或 P<0.01),显著下调 NFATc1、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12、p-AMPKα/AMPKα和TSC2的表达(P<0.05或P<0.01),增加LC3聚点。表明AMPK信号通路通过介导自噬参与OPG抑制破骨细胞分化。综上所述,活化AMPKα可诱导自噬,并负调控破骨细胞分化。OPG可促进AMPKα磷酸化和自噬,增加自噬小体数量,进而抑制破骨细胞分化。其中,抑制自噬或AMPKα的磷酸化,能够减弱OPG对破骨细胞的抑制作用。