论文部分内容阅读
盐碱化土壤是导致我国环境危机的重要因素之一,利用基因工程培育抗旱,耐盐品种已经成为解决我国土壤盐碱化日益严重问题的一条重要途径。本文对克隆获得水稻类金属硫蛋白（rgMT）基因的功能做了初步探讨,对rgMT基因在盐、重金属等逆境下的表达特性做了解析,并对在大肠杆菌、酵母表达体系中菌株的盐、重金属耐性进行了研究。为了开展苜蓿基因工程研究,该研究建立了苜蓿的再生体系及遗传转化体系。 rgMT是在碳酸盐逆境下,从水稻根cDNA文库中筛选出的一个基因,它的阅读框架（ORF）为222bp。在蛋白质数据库中通过BLAST对该基因编码蛋白的氨基酸序列进行同源性检索（DDBJ）,结果表明:其氨基酸序列与水稻的一个类金属硫蛋白基因rgMT（accessionnumber:S57768）具有100%同源性。由此,推测该基因就是水稻类金属硫蛋白基因rgMT。 利用Northern杂交方法对rgMT的表达特性进行研究,结果表明:在盐逆境（NaCl,NaHCO3）,干旱（10%PEG6000）,不同的金属离子（CuCl2,ZnCl2,CdCl2）逆境条件下,rgMT的表达量与对照相比明显增高,表明水稻rgMT基因表达与逆境存在着一定的应答关系。 利用大肠杆菌表达体系,采用蛋白质重组技术,将水稻rgMT基因重组入原核表达载体pGEX-6P-3中,然后转入E.coli BL21中进行体外表达GST融合蛋白。研究表明,重组蛋白获得了大量表达。通过纯化程序的优化,获得了高纯度的重组蛋白。GST-rgMT融合蛋白经蛋白酶水解,获得了纯化的rgMT蛋白。每克细胞（干重）中纯化出4.8毫克的rgMT,并且对rgMT的重金属离子耐受性进行了探讨。通过研究发现,既能抑制细菌的生长,又不至于使细菌死亡的适合金属离子浓度分别为CdCl2 1.6mM. CuCl2 4.7mM and ZnCl2 1.7mM。转化rgMT的大肠杆菌BL21与对照相比,对重金属耐受性都得到了增加。由于酵母是真核生物,与植物相比有类似的代谢途径,因此利用酵母表达体系,对rgMT的抗逆性进行了进一步的研究。把rgMT基因构建在酵母表达载体上,诱导表达后,观察遗传转化酵母的耐盐性和耐重金属的能力。结果表明,强化表达rgMT基因的酵母与对照相比,对各种逆境的耐性有了一定的增强。 以MS为基本培养基,在不同浓度的2,4-D与6-BA配合使用的诱导培养基上,以苜蓿子叶为外植体,诱导愈伤组织,诱导率为55—90.6%,其中2mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA诱导率最高达90.6%;浅黄色至淡绿色的愈伤组织在MS+2mg/L KT+0.3mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA分化培养基的分化率最高并且植株颜色深绿。丛生芽在1/2MS+2mg/L酵母提取物的生根培养基上再生成完整的苜蓿植株。以建立的苜蓿高频再生体系为基础,愈伤组织为转化受体,用根癌农杆菌介导法将gus基因转入苜蓿中,利用GUS组织化学染色法,研究了影响遗传转化的若干因素,获得了转基因植株100株。乙酰丁香酮的浓度100μmol/L,菌液浓度OD600为0.3-0.5,共培养时间为4天,卡那霉素浓度为50mg/L时转化频率最合适。最高转化频率可达80%。通过建立的农杆菌介导的愈伤组织转化体系将