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猪2型圆环病毒(PCV2)是近年来新发现的动物病毒之一,该病毒与猪的多种疾病综合征有关,特别是仔猪断奶后多系统衰竭综合征,该病最早于1991年在加拿大西部发现,其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等,病原学及血清学调查表明,该病在许多国家都广泛存在,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。为了了解PCV2在我国的流行现状以及研制安全、高效的疫苗用于PCV2感染的防制,本研究对PCV2 ELISA诊断方法及PCV2-PRV二价基因工程疫苗进行了研究,主要研究内容如下: 1.PCV2 ORF2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 采用PCR方法从包含PCV2全基因组的重组质粒pT-PCV中扩增PCV2 ORF2基因的完整编码区,将其克隆到pMD18-T载体后,构建了重组质粒pTORF2,经序列测定证实,该基因未发生任何碱基突变。已有报道证实ORF2蛋白N端41 aa是其在细胞内的核定位信号,为了克服全长ORF2基因在大肠杆菌中表达时表达量低或不表达的缺陷,我们采用酶切方法截去了ORF2基因5’-端的部分核定位序列,并对截短后的ORF2片断进行了表达。具体方法是用BalI和SalI双酶切pTORF2,回收含ORF2基因的小片段,并将其插入pGEX-KG原核表达载体的SmaI和SalI位点之间,构建原核表达质粒pGEX-ORF2,将该质粒转化E.coli BL21,经IPTG诱导后GST-ORF2融合蛋白得到了表达,大小与预期结果相符,且表达蛋白可与PCV2标准阳性血清反应,具有免疫学活性。 2.PCV2 ELISA诊断方法的建立及应用 SDS-PAGE分析表明,GST-ORF2融合蛋白在细菌裂解液的上清及沉淀中均存在,但主要位于裂解液的上清中,因此我们采用两种方法分别对沉淀和上清中的融合蛋白进行了提取。对于沉淀中的包涵体,我们选用十二烷基肌氨酸钠(SKL)对包涵体进行溶解,并通过TE(pH8.0)透析复性获得有活性的融合蛋白。对于上清中的可溶性蛋白,我们采用谷胱苷肽琼脂糖凝胶进行纯化,结果表明用该方法提取的融合蛋白纯度很高,但获得量较低。 为了确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数,我们对GST-ORF2可溶性蛋白和包涵体蛋白分别进行了方阵滴定,结果表明可溶性蛋白与标准阴、阳性血清的非特异性反应较低,更适宜用作诊断抗原。但考虑到包涵体蛋白提取费用低,且在对阴、阳性血清进行稍高倍数稀释时可以降低非特异性反应,从而达到与可溶性蛋白相当的诊断效果,因此我们选用GST-ORF2包涵体蛋白为ELISA方法的包被抗原。按照方阵滴定确定的抗原最佳包被浓度(1.23μg/mL)包被酶标板,建立PCV2 ELISA诊断方法,并对其进行了特异性、重复性和稳定性试验,结果表明该方法特异性、重复性良好,且在4℃可以保存至少12个月。与PCV2间接免疫荧光试剂盒的对比