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板栗(Castanea mollissima Bl.)生产中一直存在着低产问题,主要是由于雄花多、雌花少造成的。因此,选育雌花多,雄花数量少、雄花序退化或者早期脱落的丰产优质品种,是解决板栗低产的有效途径。项目组在北京市密云县板栗产区发现一株自然实生变异的板栗芽变母株,在同一株树上,一枝上的雄花序短小,而其余枝上的雄花序正常。芽变雄花序在生长发育过程中,中上部发生细胞程序性死亡(PCD),花序变黄,弯曲,最后枯死脱落,而基部的花序发育正常,雄花序的平均长度2.2cm,只有普通板栗雄花序长度的1/6-1/8。此新品种通过国家林业局审定命名为‘短花云丰’(新品种保护权：20090015)。前期研究还发现,该雄花序的短化与赤霉素密切相关,在芽变雄花序发育的整个过程贝壳杉烯酸氧化酶(KAO)表达量显著低于野生型,且活性赤霉素含量也低于野生型。本文比对了板栗野生和芽变雄花序(?)’PS、KS、KO、KAO、GA20ox1和GA3ox1基因的cDNA序列；通过构建KAO和KO基因的瞬时超表达载体,对芽变雄花序进行了侵染,以期获得芽变短雄花序赤霉素含量降低的分子机制,为芽变短雄花序的赤霉素缺陷型鉴定提供支持,同时为板栗产量的调控机制提供理论基础。主要结果如下：1.通过对赤霉素合成关键酶基因CPS、KS、KO、KAO、GA20ox1和GA3ox1在板栗花簇原基形成期的荧光定量分析发现,KAO基因在芽变雄花序中表达量极显著低于野生型,表达量只有野生型的一半。而其他五种基因在野生和芽变的花簇原基形成期相对表达量无显著差异。以板栗雄花序为模板,获得板栗KAO基因DNA全长共6086bp,有8个外显子,7个内含子。Tail-PCR扩增KAO基因启动子区域,通过比对的启动子序列,发现翻译起始位点上游-251处野生雄花序的T碱基突变为芽变型的A。2.将板栗KAO基因全长核苷酸序列插入到pCAMBIA1304质粒的BglⅡ和PmlⅠ酶切位点之间,构建成植物超表达载体pCAMBIA1304-CmKAO。在芽变短雄花序的雄花序原基形成期,以农杆菌介导将携带有KAO基因载体菌液,用1mL的注射器,在雄花序上进行注射,并进行涂抹,建立了板栗花序的瞬时表达体系。3.在表型上,侵染后20天芽变雄花序对照(MT)和空载体侵染对照(MT+EV)发生细胞程序性死亡,被侵染的雄花序(MT+KAO)未发生细胞程序性死亡,且MT+KAO长度是MT和MT+EV的2-3倍：取样后在MT+EV和MT+KAO中检测到CaMV35S,说明二者被农杆菌侵染。经荧光定量分析,KAO基因在MT+KAO表达量极显著高于MT和MT+EV。半定量分析结果也显示MT+KAO表达量明显高于MT和MT+EV。4.通过比对板栗野生和芽变雄花序CPS、KS、KO、KAO、GA20ox1和GA3ox1基因的cDNA和DNA序列,只发现两类花序的KO一个等位基因KO2中A-872,A-1115,T-1150碱基突变为芽变雄花序K03的G-872,T-1115,C-1150,分别造成了氨基酸由Glu-291、Tyr-372、Tyr-384突变为Gly-291、Phe-372、His-384,而KO另一等位基因KO1未发生碱基突变。经生物信息学分析,KO2和KO3的蛋白质分子量分别为58.765和58.651kDa,理论等电点分别为8.63和8.75,二者在二级结构中存在6处差异,且K03比K02多了一个跨膜区域。Southern杂交结果显示,KO在野生雄花序中有一个拷贝,而在芽变雄花序中有两个拷贝。5.构建了K01基因植物超表达载体pCAMBIA1304-CmKO1。在芽变短雄花序的雄花序原基形成期,对芽变短雄花序进行瞬时超表达,侵染后30天芽变雄花序对照(MT1)、空载体侵染对照(MT+EV1)和被侵染的雄花序(MT+KO1)均发生细胞程序性死亡,但经KO1基因超表达的雄花序花簇较多。取样后在MT+EV1和MT+KO1中检测到CaMV35S,说明二者被农杆菌侵染。经荧光定量分析,KO1基因在MT+KO1表达量极显著高于MT1和MT+EV1。