早在五千年前人们就开始利用蚕丝,并一直作为织造高端丝绸面料的主要原料。但是随着合成纤维的出现,蚕丝的部分市场被挤占,一方面是因为合成纤维性能优异、价格低廉;另一方面蚕丝的纤度大都集中在普通纤度水平,纤度单一,无法完全满足多样化的市场需求。但蚕丝作为天然高分子蛋白纤维,具有许多优良性能如生物相容性等是合成纤维无法替代的。因此,培育出不同纤度的家蚕品系可以在一定程度上打破蚕丝应用面狭窄的窘境。目前,研究者们主要是通过传统育种的方式来获得不同纤度的茧丝,但传统育种方法耗时长,见效慢,难以适应市场的快速变化。虽然分子育种的技术能够大大缩短育种时间,提高优良品系的育成率,但是不同纤度茧丝形成的机理尚不清楚,分子改良技术难以实施。吐丝器作为蚕丝成型的重要场所,对蚕丝的结构、性能起着至关重要的作用。因此本文以家蚕吐丝器为主要研究对象,分析吐丝器的结构形貌特征及其对成丝过程的影响,探究其与茧丝纤度和性能之间的关系;并对家蚕吐丝器的榨丝区基因表达水平进行分析,筛选出对茧丝纤度和性能相关的差异表达基因,为探究纤度的分子调控机制提供线索。本研究主要获得以下结果:1.吐丝器整体结构和形貌的解剖观察选用夏芳、秋白、苏秀和春丰四个品系的家蚕作为研究材料。利用扫描电镜和体式显微镜对家蚕吐丝器进行观察,获得了吐丝器及其相关结构的完整的微观形貌。对吐丝器的组织进行解剖,观察到吐丝器榨丝区周围6组肌肉完整的、立体的形貌及分布位置;将吐丝器管腔周围的肌肉和角质层都去掉后,清晰地观察到了组成吐丝器的共通管、榨丝区和吐丝管三个部分。2.吐丝器不同区域管腔截面差异及变化通过对吐丝器进行连续切片观察其截面,发现吐丝器不同部位,尤其是在榨丝区管腔形貌变化多样。在共通管区域,管腔形状基本保持椭圆形;榨丝区管腔形态从三角形变为半月形,且半月形的幅度大小并不一致;吐丝管区域管腔形态逐渐变为椭圆形,越靠近管口,管腔越大。对吐丝器管腔的截面大小进行统计分析,发现夏芳和秋白(普通纤度品系)不同样本之间管腔形态变化较为一致,苏秀和春丰(细纤度品系)不同样本之间变化较大,尤其是在榨丝区。这说明普通纤度吐丝器管腔形态相对稳定。细纤度品系榨丝区的管腔形状变化较大,意味着细纤度品系吐丝器管腔更容易发生形变。3.蚕丝纤维在吐丝器中的形成过程观察通过切片观测丝蛋白纤维在吐丝器中形貌变化的过程,发现丝蛋白纤维进入共通管前单丝的截面形貌是接近圆形的,在共通管部分两根单丝合并在一起变为椭圆形;当丝蛋白纤维通过榨丝区时,在周围肌肉的收缩作用下,单丝截面形貌逐渐变为三角形,最后进入吐丝管,在吐丝管管腔中出现高分子材料的挤压膨大效应,经过这段区域的调整后吐出成丝。从蚕丝形态的变化过程可知,吐丝器尤其是榨丝区对蚕丝形貌和大小均有明显的影响。为了保证茧丝截面三角形的形貌,榨丝区周围的肌肉具有一定收缩频率,根据吐丝速度和榨丝区长度,推测榨丝区周围肌肉的收缩频率约为11.42 Hz-50 Hz。根据蚕丝的粗细及其横截面形状的不均匀性,推测出榨丝区肌肉收缩是不规律的,这将会对茧丝二级结构和力学性能产生影响。4.茧丝纤度与吐丝器管腔间关系的初步分析通过比较四个品系单丝蛋白纤维进入共通管前的大小,发现普通纤度品系单丝蛋白原纤小于细纤度品系。这说明丝蛋白纤维的大小经过吐丝器后被改变了。从结论3的分析可知榨丝区对蚕丝蛋白纤维的形貌和大小影响较大,说明普通品系和细纤度品系家蚕榨丝区的活动是有差别的,这对茧丝纤度具有重要影响。目前没有发现茧丝纤度大与吐丝器管腔大小具有一致性,尚有一些疑点有待研究。5.纤度差异品系榨丝区的转录组学分析对上蔟期一天(W1)普通品系和细纤度品系榨丝区及其周围肌肉进行了转录组学的研究。通过差异分析发现夏芳与春丰之间有889个表达差异基因,与苏秀之间有373个表达差异基因,夏芳与两个细纤度品系间共有192个表达差异基因;秋白与春丰之间有525个表达差异基因,秋白与苏秀之间有506个表达差异基因,秋白与两个细纤度相比共有170个表达差异基因。利用维恩图将普通纤度与细纤度品系的基因取交集后,普通纤度与细纤度之间一共筛选到36个表达差异基因,这些差异基因中上调表达的有18个,下调表达的有18个。结合基因的功能注释,进一步对36个表达差异基因进行基因功能分析,初步筛选出了3个可能对蚕丝纤度和性能有影响的基因。(1)BGIBMGA008861(肌钙蛋白C)。该基因的功能是参与调节肌肉组织的收缩。其在细纤度品系中上调表达,可能对细纤度形成产生作用。推测细纤度品系中榨丝区周围肌肉的收缩活动会相对活跃,这会使细纤度品系中榨丝区管腔变化大,且对蚕丝的压缩作用增强。(2)BGIBMGA005899(壳寡糖β-N-乙酰氨基葡糖苷酶)。该基因的作用是参与几丁质的降解。在榨丝区的背面存在一个坚硬几丁质板,该几丁质板与榨丝区背部肌肉相连接,它在肌肉的控制下调节管腔的大小。因此,推测其在细纤度品系中显著上调表达时,对几丁质的降解作用会加强,使得细纤度品系中几丁质变少,管腔在肌肉收缩作用下容易发生变形。并且几丁质板的减少使管腔为丝蛋白成纤化提供的剪切力变小,导致细纤度蚕丝纤维的取向度降低,这也使细纤度品系茧丝的强度稍弱于普通纤度。(3)BGIBMGA000983(钾离子通道蛋白7)。它具有钾离子跨膜运输功能。现有的研究表明K~+的增加会促进再生丝素中丝蛋白由无规卷曲向β-折叠转变。因此,我们推测,当该基因在普通纤度的家蚕品系中上调表达时,可能促进普通纤度茧丝中β-折叠的形成,使普通纤度蚕丝的强度比细纤度品系略好,这与蚕丝拉伸实验结果相一致。综上所述,本研究全面地展示了吐丝器结构和形貌;分析了吐丝器对蚕丝形貌及性能之间的关系;筛选出了3个可能对茧丝纤度存在影响的基因。这为后续研究蚕丝纤度的调控机制提供了有价值的参考。