论文部分内容阅读
菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat)花朵艳丽,花期长,品种繁多是中国传统名花。但是低温、干旱、盐碱等非生物胁迫限制其生长和观赏价值。因此培育综合抗逆性强的菊花新品系对拓宽其应用范围、延长观赏时间、降低生产成本等具有重要意义。甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino]是菊科菊属的二倍体植物,遗传背景简单,分布广且具有较强的耐盐碱能力。本试验将从甘菊中分离在逆境条件下对提高植物抗逆性起到重要作用的CBF家族基因的同源基因,并对该基因进行表达模式分析、生物信息学分析及转入拟南芥以期对其功能进行分析,以此来探讨甘菊中CBF基因的表达模式与功能,以期能了解甘菊中CBF通路及为培育抗逆性强的菊花新品系提供基础。主要研究结果如下：1.用NCBI网站上的BlastX程序对课题组前期构建的甘菊转录组数据库中3个CBF (C-repeat Binding Factor)基因的核苷酸序列进行搜索比对,结果显示,这3个基因都具AP2结构域属于AP2基因家族成员。通过对甘菊幼苗进行盐胁迫、低温胁迫、高温胁迫及ABA诱导处理,分析甘菊中ClCBF基因在不同胁迫下的表达模式。结果表明：CICBF1受冷、热、盐胁迫的诱导,对盐胁迫更加敏感；ClCBF2只受盐的诱导表达,热抑制其表达；ClCBF4受到冷、盐及ABA的诱导表达,受冷诱导表达明显。相同胁迫处理条件下,表达情况不同,预示3个基因的表达模式不同。2.通过3RACE技术对CICBF1和ClCBF4基因进行全长克隆。获得CICBF1基因核苷酸序列全长为1149bp,含有633bp的开放阅读框(ORF),获得ClCBF4基因核苷酸序列全长为823bp,开放阅读框为642bp。通过对CICBF的启动子元件分析发现,ClCBF1和CICBF4这两个基因的启动子序列中都含有MYC、W-box、TATC等响应元件。而在CICBF4的启动子中检测到了ABA响应元件,在CICBF1中没有发现,这与CICBF4基因的表达情况相符合。3.对克隆得到的序列进行多序列比对,发现CICBF1和CICBF4具有CBF蛋白的特征序列,属于CBF基因家族成员,而ClCBF2非该基因家族的成员。利用MEGA5软件对转录组数据库中3个基因进行系统进化分析发现,CICBF1、CICBF4处于DREB-A1分支上,而CICBF2处于DREB-A4分枝上。4.通过双酶切的方法构建pBI121-CBF的植物表达载体,采用农杆菌侵染的方法将甘菊CICBF1和ClCBF4基因的植物表达载体转入拟南芥中,对转基因拟南芥进行卡那霉素(kana)筛选,共筛选出CICBF16个转基因株系,CICBF413个转基因株系,通过对转基因拟南芥进行RT-PCR检测,甘菊ClCBF1和CICBF4基因成功转入拟南芥。