癌症对人类的威胁日益严重,而人们在攻克癌症的征途中,却举步维艰。目前用于临床的抗肿瘤药物存在的主要问题是:选择性差,对实体瘤作用不佳,易产生多药耐药性等。本课题研究的德氮吡格(Tetrazanbigen,TNBG)是自主创新设计合成的氮杂甾烷类化合物。经体内、外实验证明,德氮吡格具有良好的抗肿瘤作用,能显著延长荷瘤动物的生存期,且无交叉耐药性。在德氮吡格对人肝癌细胞QGY-7701的实验中,观察到德氮吡格引起肿瘤细胞内大量脂滴聚积的特殊现象;基因芯片筛选出的众多差异基因中以脂代谢相关基因变化最显著。由此,我们提出德氮吡格可能通过影响肿瘤细胞的脂代谢达到抗肿瘤的目的,但其分子作用机制有待进一步研究。本文拟采用蛋白质组学方法,比较德氮吡格给药前后人肝癌细胞QGY-7701的蛋白质差异,探索德氮吡格影响肿瘤细胞脂代谢产生脂质聚积的特殊现象,以及抗肿瘤作用的机制,望能找到德氮吡格作用的靶点,为抗肿瘤药物研发提供新思路。本文完成的主要工作和结论如下:1、建立了人肝癌细胞QGY-7701的细胞浆、细胞膜、细胞核蛋白质组双向电泳分离技术。采用亚细胞抽提试剂盒提取各亚细胞组分,以不同的方法除盐浓缩蛋白质样品,然后,分别采用两种不同的水化上样缓冲液重悬样品,进行双向凝胶电泳。结果显示:联合使用丙酮、三氯乙酸的除盐效果好,样品损失少;采用上样缓冲液Ⅱ(7mol/L尿素+ 2mol/L硫脲+ 4%CHAPS + 40mmol/L Tris + 65mmol/L DTT + 2%两性电解质)有利于蛋白的溶解,获得更多的蛋白信息,检出的细胞浆蛋白点可达995±53,细胞膜蛋白点可达1035±58,细胞核蛋白点可达893±45。2、利用上述建立的双向电泳技术,分离德氮吡格(4μg/mL)给药前后的人肝癌细胞QGY-7701的细胞浆、细胞膜、细胞核蛋白,用PDQuest(7.4.0)软件进行比较分析、寻找二倍以上的差异表达蛋白。结果显示:德氮吡格作用于人肝癌细胞QGY-7701 72h后,细胞浆的差异表达蛋白点有56个,细胞膜的差异表达蛋白点有65个,细胞核的差异表达蛋白点有34个,共计差异表达蛋白点有155个。3、结合基因芯片,从155个差异表达蛋白点中筛选出14个细胞浆蛋白点、25个细胞膜蛋白点、9个细胞核蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱分析,MS-Fit数据库鉴定。结果鉴定出33个差异表达蛋白,其中包括与脂质合成有关的11个蛋白,与脂质降解有关的4个蛋白和与脂质转运有关的3个蛋白。在这些差异蛋白中与脂代谢有关的蛋白变化最明显,蛋白质组学研究结果与基因芯片研究结果一致。4、采用Western blot方法,对变化显著的脂代谢信号转导通路的上游调控因子SREBP-1和脂质转出途径关键蛋白MTTP进行研究。实验结果显示:4μg/mL德氮吡格作用于人肝癌细胞QGY-7701 72h后,SREBP-1的表达增加,MTTP的表达降低,蛋白水平的验证结果与比较蛋白质组学的分析结果一致。从蛋白质水平上,这进一步支持德氮吡格抗肿瘤作用的主要机制是通过干扰肿瘤细胞的脂代谢。5、通过上述差异蛋白的功能分析可知,德氮吡格对肿瘤细胞脂代谢调控所导致肿瘤细胞内脂质大量聚积可能通过以下几条途径:①SREBP-2调控的胆固醇合成增加途径;②SREBP-1调控的甘油三酯合成增加途径;③脂质分解途径被抑制;④MTTP调控的脂质转出途径被抑制。由此可知,德氮吡格除通过SREBPs途径增加胆固醇和甘油三酯合成外,导致肿瘤细胞内脂质大量聚积主要原因可能是德氮吡格抑制了MTTP对脂质转出的途径。综上所述,本论文以人肝癌细胞QGY-7701作为研究模型,从蛋白质水平上,探索了德氮吡格的抗肿瘤作用机制,并初步确证德氮吡格抑制MTTP是导致肿瘤细胞内脂质大量聚积的主要原因,并可作为抗肿瘤作用的新靶点。