糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的严重慢性并发症,是各种慢性肾病导致终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)的主要病因。严格的血糖控制虽然能延缓DN的发展,但却不能阻断DN发展至ESRD.在过去的几十年中,系膜细胞和肾小球基底膜是许多DN相关研究的焦点。但近来多个临床及实验室动物的研究证实,糖尿病肾病中蛋白尿发生的起始因素与足细胞病变,如足细胞肥大、剥离、足细胞凋亡密切相关。近年来炎症因素在糖尿病肾病发病中的作用受到越来越多学者的重视。肾脏固有细胞在病理状态下可以产生多种炎症因子,这些因子又通过自分泌和旁分泌的方式使炎症效应不断扩大,从而引起炎症级联反应。这些细胞因子在糖尿病患者微血管并发症,包括糖尿病肾病的发病中占有重要地位,如诱导发生胰岛素抵抗、增加前列腺素E2的合成、诱导系膜细胞增殖或对肾脏细胞产生直接的毒性作用。正常状态下机体可产生少量活性氧簇(ROS)参与代谢,同时体内存在清除自由基反应的体系,使过多的自由基被清除或使自由基产生减少,从而使ROS的产生和清除处于动态平衡状态。但是糖尿病可使这一平衡遭到破坏,ROS产生增多或清除减少,导致ROS在体内蓄积而引起多种肾脏细胞尤其是足细胞损伤。因此炎症及氧化应激已经成为糖尿病肾病治疗的重要靶点。寻找及探讨既能有效抗炎、抗氧化,而且又无明显毒副作用的药物显得尤为重要。和厚朴酚(honokiol, HNK)是从木兰科植物中纯化得到的活性成分,是亚洲传统的医药植物之一。随着HNK研究进展,HNK已被证明具有许多有益的药理作用,包括抗炎、抗焦虑、抗菌、抗肿瘤及抗氧化等多重作用。因此,本研究将着重评价HNK对高糖、LPS刺激的肾系膜细胞炎症反应及氧化应激环境下肾小球上皮即足细胞凋亡的影响,并通过检测细胞内信号分子的变化探讨其作用机制,积极探索及寻找糖尿病肾病的有效治疗药物。第一部分和厚朴酚对高糖诱导的人肾小球系膜细胞炎性因子表达的抑制作用目的：评估和厚朴酚对高糖(high glucose, HG)诱导人肾系膜细胞(human renal mesangial cell, HRMC)炎症反应的调节作用。材料及方法：MTS检测不同浓度和厚朴酚作用后HRMC的细胞增殖活力,以确定和厚朴酚的工作浓度。使用Annexin V染色,并用流式细胞学方法检测不同浓度HG对细胞凋亡率的影响,以此确定后续实验的HG浓度。应用酶联免疫吸附实验检测不同浓度和厚朴酚对HG作用后系膜细胞上清液中炎症相关因子白介素(interleukin, IL)-1β, IL-18,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α,转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1, CC趋化因子配体[(C-C motif) ligand, CCL]-2, CCL-3, CCL-5及前列腺素(prostaglandin, PG) E2蛋白的表达水平。总一氧化氮(nitric oxide, NO)浓度测定使用格里斯反应方法来测定。结果：和厚朴酚在<20μmol/l浓度时并未显著改变HRMC的细胞增殖活性,但当浓度>40μmol/l时可显著降低HRMC的细胞增殖率。经流式细胞学检测,50mmol/1的葡萄糖浓度未显著影响细胞的凋亡率,因此被作为后续实验的工作浓度。酶联免疫吸附实验结果显示50mmol/l的葡萄糖导致HRMC细胞中的IL-1β、IL-18、TNF-α、PGE2、 NO、TGF-β1、CCL-2、CCL-3及CCL-5蛋白水平显著增加。和厚朴酚(0-20μmol/1)的处理强烈抑制了HG诱导的炎性细胞因子,如IL-1β、IL-18、TNF-α PGE2、TGF-β1及NO的蛋白表达,结果表现为剂量依赖性。此外,和厚朴酚能抑制趋化因子如CCL-2,CCL-3及CCL-5蛋白的表达。结论：和厚朴酚能强烈抑制HG刺激的HRMC炎症因子的表达增加的作用。和厚朴酚可能是一种有前景的具有强大抗炎作用的药物。第二部分和厚朴酚对脂多糖诱导的人肾系膜细胞炎症反应及其细胞内信号分子的抑制作用目的：观察和厚朴酚对脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)诱导人肾小球系膜细胞炎症反应及细胞内信号通路的作用及机制。材料及方法：通过MTS法检测HRMC的增殖率,确定LPS对HRMC的毒性浓度。酶联免疫吸附试验初步检测不同浓度LPS作用下HRMC中TNF-a与CCL-2的蛋白表达,并结合MTS结果选择LPS的后续工作浓度。应用酶联免疫吸附试验检测系膜细胞上清液中炎症相关因子IL-1β, IL-18, TNF-α, TGF-β1, CCL-2,CCL-3,CCL5及PGE2蛋白的表达水平,格里斯反应法来测定总NO浓度。Western免疫印迹法测定总的及磷酸化的核因子-κB (nuclear factor-kappaB, NF-κB) p65亚基、核因子-κB抑制蛋白激酶α/β (inhibitor of kappa B kinase complex-alpha/beta,IKKa/β)、核因子κB抑制蛋白(Inhibitor kappaB, IκB)-α、丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinases, Akt)、P42/44丝裂原活化蛋白激酶(P42/44mitogen-activated protein kinase, p42/44MAPK)蛋白,环氧化酶(cyclooxygenase,COX)-2及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)蛋白表达水平结果：当LPS浓度小于等于1μg/ml时,随着LPS浓度的增加TNF-a. CCL-2的蛋白表达逐渐增加,1μg/ml与2μg/ml时无明显区别。且小于2μg/ml浓度的LPS未对HRMC的细胞增殖活性产生影响,所以在后续实验中,我们把LPS1μg/ml作为刺激浓度。本研究中,LPS处理后可导致的HRMC的IL-1β、IL-18、TNF-α、TGF-β1、CCL-2、CCL-3及CCL-5的水平明显上调。随着COX-2及iNOS蛋白表达的增加,其产物PGE2和NO也有所增加。但这些分子的上调均被和厚朴酚显著抑制,且作用呈剂量依赖性。和厚朴酚不仅在10μmol/l时完全逆转了IL-1β及CCL-3的表达水平,而且在20μmol/l还完全逆转了(?)NF-α, IL-18和TGF-β1的表达。此外,细胞内信号分子NF-κB的p65亚基,IKK-alpha/beta, IκB-α, Akt, p42/44MAPK的磷酸化水平也被和厚朴酚显著抑制。结论：和厚朴酚能抑制LPS诱导HRMC中炎性细胞因子上调的作用。其机制部分可能是由于抑制了NF-κB p65、Akt、p42/44MAPK蛋白的磷酸化及COX-2、 iNOS蛋白的途径发挥其抗炎作用。第三部分和厚朴酚保护氧化应激导致的小鼠足细胞凋亡的作用及机制研究目的：氧化应激是糖尿病等多种疾病导致肾组织损伤的共同因素,也是导致足细胞凋亡的重要原因之一。本研究以H202刺激下体外培养的小鼠足细胞为研究对象,探讨HNK对足细胞凋亡及部分细胞内信号分子表达的影响从而探讨其作用及机制。方法：以100μM的H2O2刺激小鼠足细胞株为研究对象,加入低(1.25μmol/l)、中(5μmol/l)、高浓度(20μmol/l)的HNK预处理后：首先在相差显微镜下观察上清中漂浮细胞的数量及贴壁细胞的一般状态。使用MTS法及流式细胞学方法检测足细胞的细胞增殖活性及凋亡率。应用实时定量聚合酶链反应及免疫的印迹法观察凋亡蛋白caspase-3及caspase-9的改变。使用免疫印迹法检测Erk1/2及Akt信号分子的磷酸化水平,以进一步探讨HNK抗氧化作用的可能机制。结果：加入H2O2这一活性氧簇后,足细胞增殖率减少,细胞状态变差,光镜下可见细胞内多量的小黑点,可能为肿胀的细胞器。MTS及Annexin V/PI双染色进一步证实H2O2可导致足细胞增殖率的下降及细胞凋亡率的明显增加。使用不同浓度HNK处理24h后,随着HNK浓度的增加,上清液中漂浮的死细胞逐渐减少,贴壁细胞状态好转,细胞逐渐变得透明,且细胞增殖率也随之增加,细胞凋亡率明显下降。Real-time PCR及western免疫印迹方法的结果显示,HNK可显著下调由于H2O2刺激的凋亡相关半胱氨酰蛋白酶(apoptosis-related cysteine protease, caspase)-3及caspase-9活性蛋白及其mRNA的表达增加。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-activated kinases, Erk)1/2及Akt信号分子的磷酸化水平在加入H202后24h未见明显下降,反而似可见少量增加。且低、中、高浓度HNK进一步增加了两者的磷酸化水平结论：HNK能缓解氧化应激环境促足细胞凋亡的作用,对H202培养下足细胞有保护作用,且HNK能明显减少caspase-3及caspase-9活性蛋白及其mRNA的表达可能是足细胞凋亡率减少的重要机制。而HNK使得Erkl/2及Akt信号分子的磷酸化水平进一步增加可能也是其作用机制之一。但仍需进一步检测Erk1/2及Akt蛋白的时间-磷酸化效应曲线来进一步探讨其变化规律。