背景:慢性阻塞性肺病(简称慢阻肺)的发生发展与Th1/Th2,Th17/Treg失衡密切相关。细颗粒物(PM2.5)能够导致包括呼吸系统在内的全身多种个系统和器官出现功能紊乱和病理状态,加重慢阻肺病情。Notch信号通路在T淋巴细胞的分化、发育中过程起重要作用,其活性能够被γ-分泌酶抑制剂(GSI)阻断。目前有关PM2.5对慢阻肺免疫失衡的影响机制的研究仍鲜见报道。目的:本研究采集PM2.5,通过复制慢阻肺小鼠模型,观察PM2.5暴露前后慢阻肺小鼠脾脏T淋巴细胞Th1、Th2、Th17、Treg亚群比例,Notch信号通路中Notch1/2/3/4受体及其下游产物Hes1/5、Hey1在慢阻肺小鼠脾脏T淋巴细胞中的表达,及血清干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-4、IL-17和IL-10分泌,探讨PM2.5对小鼠Notch信号通路和免疫功能紊乱的影响,及其加速慢阻肺发生发展的机制。方法:SPF级6-8周龄雄性BALB/c小鼠80只,随机分为健康对照组,健康+PM2.5组,健康+GSI组,健康+PM2.5+GSI组,慢阻肺组,慢阻肺+PM2.5组,慢阻肺+GSI组,慢阻肺+PM2.5+GSI组。采集兰州市天水路交通主干线旁的PM2.5;采用单纯香烟烟雾暴露法建立慢阻肺小鼠模型,雾化吸入PM2.5干预,腹腔注射GSI;采用小鼠肺功能无创测量系统检测肺功能;颈椎脱臼法处死小鼠,取小鼠肺组织制作肺组织病理切片,行HE染色观察记录小鼠肺组织病理学改变;采用密度梯度离心法及尼龙毛柱法分离提纯小鼠脾脏T淋巴细胞;采用流式细胞术检测T淋巴细胞Th1%、Th2%、Th17%、Treg%并计算Th1/Th2、Th17/Treg比值;采用RT-PCR法检测T淋巴细胞Notch1/2/3/4受体、Hes1/5、Hey1分子m RNA含量;采用免疫印迹法检测T淋巴细胞Notch1/2/3/4受体、Hes1/5、Hey1分子蛋白表达;摘眼球法采集小鼠静脉血并分离血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠血清INF-γ、IL-4、IL-17、IL-10浓度。结果:(1)单纯香烟烟雾暴露法可成功建立慢阻肺小鼠模型。慢阻肺组小鼠体重(26.17±3.11)g较健康对照组(38.53±3.65)g明显减轻,差异有显著统计学意义(P<0.01);慢阻肺+PM2.5组小鼠体重(21.58±1.11)g较健康+PM2.5组和慢阻肺组(33.76±1.64、26.17±3.11)均明显减轻,差异有显著统计学意义(均P<0.01);慢阻肺+PM2.5+GSI组小鼠体重(25.94±4.06)g较慢阻肺+PM2.5组(21.58±1.11)g明显增加,差异有显著统计学意义(P<0.01)。慢阻肺组小鼠吸气峰值流速(PIF)和呼气峰值流速(PEF)(7.57±0.31、4.81±0.32)ml/s较健康对照组(9.75±0.45、7.77±0.33)ml/s明显降低,差异有显著统计学意义(P<0.01);慢阻肺+PM2.5小鼠PIF和PEF(5.80±0.30、3.89±0.29)ml/s较健康+PM2.5组(8.42±0.38、6.11±0.22)ml/s和慢阻肺组(7.57±0.31、4.81±0.32)ml/s均明显降低,差异均有显著统计学意义(均P<0.01);慢阻肺+PM2.5+GSI组小鼠PIF和PEF(6.65±0.36、4.27±0.31)ml/s较慢阻肺+PM2.5组(5.80±0.30、3.89±0.29)ml/s明显升高,差异有显著统计学意义(P<0.01)。镜下可见慢阻肺小鼠肺组织出现明显的肺气肿改变和支气管炎症;慢阻肺+PM2.5组小鼠肺气肿改变和支气管炎症较慢阻肺组程度重;慢阻肺+PM2.5+GSI组小鼠肺气肿改变及炎性细胞浸润和支气管炎症较慢阻肺+PM2.5组小鼠程度减轻;而健康对照组小鼠肺组织无此病理改变。(2)健康+PM2.5组Th1%、Th17%、Th1/Th2及Th17/Treg(19.61±1.22、18.16±1.37)%、(30.50±3.56、34.81±5.15)较健康对照组(7.84±0.73、5.59±1.49)%、(9.65±2.01、5.81±3.03)均升高,健康+PM2.5组Th2%、Treg%(0.65±0.09、0.53±0.08)%较健康对照组(1.13±0.39、1.18±0.60)%均降低,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05);慢阻肺组Th1%、Th17%、Th1/Th2及Th17/Treg(19.40±3.03、17.69±5.08)%、(31.85±3.67、22.50±7.72)较健康对照组(7.84±0.73、5.59±1.49)%、(9.65±2.01、5.81±3.03)均升高,慢阻肺组Th2%、Treg%(0.75±0.17、0.84±0.29)%较健康对照组(1.13±0.39、1.18±0.60)%均降低,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05);慢阻肺+PM2.5组Th1%、Th17%、Th1/Th2及Th17/Treg(37.60±2.86、32.16±6.06)%、(39.02±8.73、77.32±2.21)较健康+PM2.5组(19.61±1.22、18.16±1.37)%、(30.50±3.56、34.81±5.15)和慢阻肺组(19.40±3.03、17.69±5.08)%、(31.85±3.67、22.50±7.72)均升高,慢阻肺+PM2.5组Th2%、Treg%(0.51±0.14、0.45±0.16)%较健康+PM2.5组(0.65±0.09、0.53±0.08)%和慢阻肺组(0.75±0.17、0.84±0.29)%均降低,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05);慢阻肺+PM2.5+GSI组Th1%、Th17%、Th1/Th2及Th17/Treg(22.75±3.88、27.57±7.38)%、(33.53±5.07、38.72±1.50)较慢阻肺+PM2.5组(37.60±2.86、32.16±6.06)%、(39.02±8.73、77.32±2.21)均减低,慢阻肺+PM2.5+GSI组Th2%、Treg%(0.71±0.10、0.77±0.23)%较慢阻肺+PM2.5组(0.51±0.14、0.45±0.16)%均升高,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。(3)健康+PM2.5组小鼠脾脏T淋巴细胞表面Notch1/2/3/4受体、Hes1/5、Hey1m RNA含量(5.87±1.22、6.52±2.49、6.49±2.26、7.06±1.12、5.57±1.82、5.32±1.42、8.44±3.84)较健康对照组(1.03±0.29、1.09±0.46、1.01±0.13、1.06±0.38、1.10±0.55、1.08±0.44、1.06±0.43)均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺组小鼠脾脏T淋巴细胞表面Notch1/2/3/4受体、Hes1/5、Hey1 m RNA含量(11.56±1.39、11.89±3.42、11.25±3.19、9.70±2.38、6.98±1.97、9.49±1.89、13.20±3.89)较健康对照组(1.03±0.29、1.09±0.46、1.01±0.13、1.06±0.38、1.10±0.55、1.08±0.44、1.06±0.43)均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺+PM2.5组小鼠脾脏T淋巴细胞表面Notch1/2/3/4受体、Hes1/5、Hey1 m RNA含量(23.11±5.98、20.14±1.89、21.80±4.30、21.99±4.30、16.59±1.30、17.98±7.08、23.57±2.90)较健康+PM2.5组(5.87±1.22、6.52±2.49、6.49±2.26、7.06±1.12、5.57±1.82、5.32±1.42、8.44±3.84)和慢阻肺组(11.56±1.39、11.89±3.42、11.25±3.19、9.70±2.38、6.98±1.97、9.49±1.89、13.20±3.89)均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺+GSI组小鼠脾脏T细胞Hes1/5、Hey1 m RNA含量(4.27±1.60、6.40±1.52、8.62±2.59)较慢阻肺组(6.98±1.97、9.49±1.89、13.20±3.89)均降低,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺+PM2.5+GSI组小鼠脾脏T淋巴细胞表面Notch1/2/3/4受体、Hes1/5、Hey1 m RNA含量(17.05±2.40、16.48±2.41、16.09±5.13、15.02±1.38、10.28±0.26、13.96±3.63、18.65±4.53)较慢阻肺+PM2.5组(23.11±5.98、20.14±1.89、21.80±4.30、21.99±4.30、16.59±1.30、17.98±7.08、23.57±2.90)均降低,差异均有统计学意义(均P<0.01)。(4)健康+PM2.5组小鼠脾脏T淋巴细胞表面Notch1/2/3/4受体、Hes1/5、Hey1蛋白表达量(0.78±0.04、0.88±0.06、0.76±0.05、0.93±0.07、0.89±0.07、0.83±0.09、0.87±0.04)较健康对照组(0.30±0.04、0.30±0.04、0.35±0.08、0.24±0.02、0.54±0.04、0.38±0.06、0.53±0.04)均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺组小鼠脾脏T淋巴细胞表面Notch1/2/3/4受体、Hes1/5、Hey1蛋白表达量(1.11±0.13、1.06±0.05、0.89±0.05、0.99±0.14、0.97±0.05、1.16±0.07、0.95±0.07)较健康对照组(0.30±0.04、0.30±0.04、0.35±0.08、0.24±0.02、0.54±0.04、0.38±0.06、0.53±0.04)均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺+PM2.5组小鼠脾脏T淋巴细胞表面Notch1/2/3/4受体、Hes1/5、Hey1蛋白表达量(1.51±0.09、1.63±0.10、1.34±0.13、1.54±0.14、1.51±0.06、1.75±0.14、1.81±0.17)较健康+PM2.5组(0.78±0.04、0.88±0.06、0.76±0.05、0.93±0.07、0.89±0.07、0.83±0.09、0.87±0.04)和慢阻肺组(1.11±0.13、1.06±0.05、0.89±0.05、0.99±0.14、0.97±0.05、1.16±0.07、0.95±0.07)均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺+GSI组小鼠脾脏T细胞Hes1/5、Hey1蛋白表达量(0.81±0.06、0.59±0.05、0.79±0.05)较慢阻肺组(0.97±0.05、1.16±0.07、0.95±0.07)均降低,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺+PM2.5+GSI组小鼠脾脏T淋巴细胞Notch1/2/3/4受体、Hes1/5、Hey1蛋白表达量(1.36±0.10、1.35±0.07、1.11±0.07、1.23±0.10、1.28±0.07、1.47±0.08、1.40±0.13)较慢阻肺+PM2.5组(1.51±0.09、1.63±0.10、1.34±0.13、1.54±0.14、1.51±0.06、1.75±0.14、1.81±0.17)均降低,差异均有统计学意义(均P<0.01)。(5)健康+PM2.5组小鼠血清中IFN-γ、IL-17(26.70±1.59、55.69±3.19)pg/ml分泌较健康对照组(17.67±1.71、44.14±3.86)pg/ml均增加,健康+PM2.5组小鼠血清中IL-4、IL-10分泌(20.20±1.39)pg/ml、(3.23±0.68)ng/ml较健康对照组(25.45±2.29)pg/ml、(4.15±1.40)ng/ml均减少,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺组小鼠血清中IFN-γ、IL-17分泌(55.46±1.49、60.70±2.57)pg/ml较健康对照组(17.67±1.71、44.14±3.86)pg/ml均增加,慢阻肺组小鼠血清中IL-4、IL-10分泌(15.86±1.84)pg/ml、(2.60±0.47)ng/ml较健康对照组(25.45±2.29)pg/ml、(4.15±1.40)ng/ml均减少,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺+PM2.5组小鼠血清中IFN-γ、IL-17分泌(71.27±1.57、71.15±3.69)pg/ml较健康+PM2.5组(26.70±1.59、55.69±3.19)pg/ml和慢阻肺组(55.46±1.49、60.70±2.57)pg/ml均增加,慢阻肺+PM2.5组小鼠血清中IL-4、IL-10分泌(12.66±1.37)pg/ml、(0.57±0.19)ng/ml较健康+PM2.5组(20.20±1.39)pg/ml、(3.23±0.68)ng/ml和慢阻肺组(15.86±1.84)pg/ml、(2.60±0.47)ng/ml均减少,差异均有统计学意义(均P<0.01);慢阻肺+GSI组小鼠血清中IFN-γ、IL-17分泌(49.83±2.20、54.30±3.00)pg/ml较慢阻肺组(71.27±1.57、71.15±3.69)pg/ml均减少,慢阻肺+GSI组小鼠血清中IL-4、IL-10分泌(16.82±1.19)pg/ml、(3.32±0.14)ng/ml较慢阻肺组(15.86±1.84)pg/ml、(2.60±0.47)ng/ml均增加,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05);慢阻肺+PM2.5+GSI组小鼠血清中IFN-γ、IL-17分泌(60.95±3.15、65.19±2.64)pg/ml较慢阻肺+PM2.5组(71.27±1.57、71.15±3.69)pg/ml均减少,慢阻肺+PM2.5+GSI组小鼠血清中IL-4、IL-10分泌(14.40±1.29)pg/ml、(1.51±0.12)ng/ml较慢阻肺+PM2.5组(12.66±1.37)pg/ml、(0.57±0.19)ng/ml均增加,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。(6)相关性分析:各组小鼠Notch1/2/3/4、Hes1/5、Hey1蛋白表达与Th1/Th2、Th17/Treg分别呈正相关(r=0.854～0.867,P<0.01或P<0.05);各组小鼠Th1%与IFN-γ含量分别呈正相关(r=0.666～0.915,P<0.01或P<0.05);各组小鼠Th2%与IL-4含量分别呈正相关(r=0.650～0.804,P<0.01或P<0.05);各组小鼠Th17%与IL-17含量分别呈正相关(r=0.638～0.840,P<0.01或P<0.05);各组小鼠Treg%与IL-10含量分别呈正相关(r=0.652～0.804,P<0.01或P<0.05)。结论:单纯香烟烟雾暴露法能够成功建立小鼠慢阻肺模型;慢阻肺小鼠存在以Th1、Th17升高为主的免疫失衡;PM2.5可以导致健康小鼠出现以Th1,Th17异常升高为主的免疫紊乱,并加剧慢阻肺小鼠的Th1/Th2,Th17/Treg免疫失衡;Notch信号通路参与慢阻肺免疫失衡的发生发展;PM2.5通过Notch信号通路的活化,加重慢阻肺的免疫紊乱。