鸭疫里默氏杆菌自然弱毒株的部分特性研究

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鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的鸭传染性浆膜是家鸭、火鸡和多种其它鸟类的一种接触传染性疾病。该病呈世界范围分布,几乎已在所有的集约化养鸭生产的国家发现。该病的发病率和死亡率较高,已成为目前危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一,给养鸭业造成了巨大的经济损失。本实验室在前期对我国鸭传染性浆膜炎的病原流行病学进行了研究,分离、鉴定、保存有500余株鸭疫里默氏杆菌。本文在此基础上筛选出2株低致病力的鸭疫里默氏杆菌,通过16SrDNA核苷酸序列测定及对雏鸭的半数致死量与毒力稳定性测定,确证为鸭疫里默氏杆菌自然弱毒株,并对其侵袭性、培养滤液的细胞毒性、免疫原性、培养及生化特性等进行研究,可为进一步研究鸭疫里默氏杆菌毒力因子和弱毒菌苗等提供材料。本研究的主要结果如下:1.以扩增细菌16SrDNA的通用引物(16S-8F/20)和(16S-1512R/21)为引物,以基因组DNA为模板进行PCR扩增,测序显示DY株和517株的扩增部分片段大小分别为1436bp和1440bp,BLAST软件分析发现二者的核苷酸序列与已报道鸭疫里氏杆菌的同源性均达到99%以上,且相互之间的同源性为99%以上。2.鸭疫里默氏杆菌自然弱毒517株和DY株对14日龄非免健康四川麻鸭的半数致死量分别为1.18×1010CFU和2.3×1010CFU;二者在10-14日龄非免健康鸭体内连传10代后的半数致死量分别为1.02×1010和2.2×1010CFU。3.鸭疫里默氏杆菌自然弱毒517株和DY株利用LB培养,去细胞培养物经超滤浓缩、硫酸铵沉淀、透析除盐及微孔滤膜过滤除菌制备的培养滤液与鸭成纤维细胞共培养,在4小时内成纤维细胞形态与空白对照间差异不明显,而阳性对照AF株则呈现细胞膜消失、胞质流失与核浓缩等;517株和DY株与鸭胚成纤维细胞共作用5h测得侵袭力分别为1320(CFU/ml)和1262(CFU/ml),与强毒AF株1510(CFU/ml)间差异显著(0.01<p<0.05)。4.鸭疫里默氏杆菌自然弱毒517株和DY株灭活菌液与矿物油佐剂乳化制成灭活菌苗(5.5×109CFU/ml)免疫5日龄四川麻鸭,0.5ml/只,免疫后21天的血清抗体水平(ELISA)分别为1.618和1.884(A值)、同血清型强毒菌株攻毒保护率均为100%,28天的血清抗体水平分别为1.549和1.724、攻毒保护率均为100%;1.1×107CFU活菌接种后,试验鸭无明显的临床表现,21天的血清抗体水平分别为1:17和1.379、攻毒保护率均为80%,28天的血清抗体水平分别为1.289和1.491、攻毒保护率分别为75%和100%。5.鸭疫里默氏杆菌自然弱毒517株和DY株为具有荚膜的革兰氏阴性小杆菌,在巧克力营养平板上生长旺盛,菌落为奶油状,能在LB营养琼脂平板上生长;除517株发酵血清菊糖、阿拉伯糖和DY株发酵血清菊糖、阿拉伯糖、糊精外,不利用葡萄糖等其它碳水化合物;过氧化氢酶均呈阳性;明胶液化试验均呈阴性;对青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、痢特灵、复方新诺民、奈替米星等具有抗性。本试验结果表明,鸭疫里默氏杆菌517株和DY株为有荚膜、不液化明胶、能诱导动物产生良好免疫应答的毒力稳定的自然弱毒菌株,具有鸭疫里默氏杆菌典型的形态大小,能在LB培养基中生长,可作为比较基因组学等研究毒力因子及疫苗开发的基础菌株。
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