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由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici)引起的小麦条锈病是小麦生产上的一种重要病害,其大流行年份常常引起小麦的减产甚至绝收。对小麦条锈菌侵染小麦早期事件的研究特别是在分子水平上了解条锈菌的侵染机制将为小麦条锈病的防治奠定理论基础。角质层分布于植物地上部分的表层,构成了病原菌侵入寄主第一道屏障。角质酶是病原真菌中分泌产生的很重要的酶类,此类酶在某些病原菌侵入寄主植物的初期阶段起到很重要的作用。病原真菌所分泌的角质酶能够降解角质层从而为病原菌成功侵入寄主植物奠定了基础。本课题组前期建立了小麦条锈菌萌发夏孢子的cDNA文库并且鉴定出cDNA文库内含有角质酶基因的序列信息。为了进一步明确小麦条锈菌角质酶在小麦条锈菌-小麦互作过程中的作用,本研究对小麦条锈菌角质酶的基因进行了克隆、表达分析并且制备了对小麦条锈菌角质酶特异的抗体。1.小麦条锈菌角质酶基因的克隆。筛选小麦条锈菌萌发夏孢子cDNA文库获得基因全长。2.小麦条锈菌角质酶基因序列的生物信息学分析。小麦条锈菌角质酶基因全长为1129bp,编码区ORF长735bp, 5’非翻译区为92bp,3’非翻译区为302bp。小麦条锈菌角质酶由244个氨基酸残基组成,其前19个氨基酸是典型的信号肽结构,经跨膜结构分析,其并没有跨膜结构,小麦条锈菌角质酶是一个分泌蛋白。3.利用Real-time PCR对小麦条锈菌角质酶基因进行表达模式分析,结果表明角质酶基因主要在小麦条锈菌侵染小麦的早期进行表达,接种后6小时表达明显,并且在接种后24小时表达最高。4.将小麦条锈菌角质酶基因转入到大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。将条锈菌角质酶基因的ORF插入到pGEM T-easy克隆载体中,获得的重组质粒PSCUT1-pGEM-T用XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切,回收酶切片断定向克隆到表达载体pET-32a中,获得小麦条锈菌角质酶基因原核表达载体PSCUT1-pET-32a,把测序验证过的重组质粒转化到表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中,并对其表达条件进行优化,表达出约44kDa的融合蛋白,最后大量诱导表达。5.用纯化的融合蛋白制备抗体和利用Western杂交检测抗体的特异性。用尿素和His-Trap亲和柱对包涵体蛋白进行纯化,纯化后蛋白经SDS-PAGE电泳检测显示只有一个条带。然后利用纯化的融合蛋白免疫兔子得到抗体,Western杂交显示抗体的特异性较好,可以用于免疫胶体金等分析。本研究克隆得到了小麦条锈菌角质酶基因的全长序列,然后利用Real-time PCR技术研究其在不同时间阶段的表达水平,并利用原核表达得到纯度较高的融合的角质酶蛋白和制备特异的抗体,为进一步研究小麦条锈菌角质酶在小麦-条锈互作过程中的作用及功能奠定了基础。