【摘 要】
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酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是自然界中广泛分布的一种单细胞真核生物。随着对整个酵母基因组研究的深入,越来越多的基因功能被发现注释,同时发现酵母体内含有较多的遗传丰余,这些冗余序列的存在无疑多消耗了酵母生长的资源,造成了代谢途径中的部分物质和能量浪费。去除酵母基因组中的遗传丰余,减少代谢途径中不必要消耗的物质和能量,使更多的代谢流流向必需基因和外源表达模块,提高目标产
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酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是自然界中广泛分布的一种单细胞真核生物。随着对整个酵母基因组研究的深入,越来越多的基因功能被发现注释,同时发现酵母体内含有较多的遗传丰余,这些冗余序列的存在无疑多消耗了酵母生长的资源,造成了代谢途径中的部分物质和能量浪费。去除酵母基因组中的遗传丰余,减少代谢途径中不必要消耗的物质和能量,使更多的代谢流流向必需基因和外源表达模块,提高目标产物的产量,对于构建稳定高产的工业生产菌株具有重要的研究意义。本论文利用Latour系统和CRISPR/Cas9系统对酿酒酵母基因组进行编辑,取得了如下成果:1.酿酒酵母基因编辑CRISPR/Cas9系统的建立本研究通过对酿酒酵母基因组序列分析确定拟敲除非必需DNA大片段,根据拟敲除片段的两端序列设计gRNA,将gRNA序列连接至含Cas9蛋白编码序列的质粒,构建了适用于酿酒酵母DNA大片段敲除的CRISPR/Cas9系统;将构建好的质粒转化酿酒酵母感受态细胞,筛选转化子;对转化子进行传代,筛选缺失体,验证结果表明该操作系统能够有效地对酿酒酵母基因组进行DNA大片段的敲除。2.基于Latour系统的酿酒酵母单倍体菌株大片段敲除以酿酒酵母单倍体菌株JM（matα,?ura3）为供试菌株,基于Latour系统获得了2株单段序列缺失体:分别命名为菌株JM-XⅢa L,缺失染色体XⅢ99 794-111 550 nt之间的DNA片段,共11 kb;菌株JM-XV4,缺失XV 472 597-503 553 nt之间的DNA片段,共31 kb。以酿酒酵母单倍体菌株JM-XV2-1（matα,?ura3）（缺失染色体XV 142555-181 682 nt和371 685-411 459 nt片段）为供试菌株,获得了2株大片段叠加缺失体,分别命名为JM-XV2-1-3,缺失染色体XV 142 555-181 682 nt、202 696-226 611 nt和371685-411 459 nt之间的DNA片段,共102 kb;JM-XV2-1-3-4,缺失染色体XV 142 555-181682 nt、202 696-226 611 nt、371 685-411 459 nt和472 597-503 553 nt之间的DNA片段,共133 kb。3.基于CRISPR/Cas9系统的酿酒酵母单倍体菌株大片段敲除以单倍体酿酒酵母菌株JM（matα,?ura3）为供试菌株,基于CRISPR/Cas9系统获得了2株单段序列缺失体:分别命名为菌株JM-XⅢa C,缺失染色体XⅢ99 794-111 550nt之间的DNA片段,共11 kb;菌株JM-Va,缺失染色体V 25 635-42 593 nt之间的DNA片段,共17 kb。以JM-XⅢ1-2-3（matα,?ura3）（缺失染色体XⅢ298 868-327 482 nt、339 301-352 281 nt、706 921-722 613 nt片段）为供试菌株,获得两株大片段叠加缺失突变株,分别命名为菌株JM-XⅢ-1-2-3-4a,缺失染色体XⅢ298 868-327 482 nt、339 301-352281 nt、706 921-722 613 nt和99 794-111 550之间的DNA片段,共68 kb;菌株JM-XⅢ-1-2-3-V4a,缺失染色体XⅢ的298 868-327 482 nt、339 301-352 281 nt、706921-722 613 nt和染色体V 25 635-42 593nt之间的DNA片段,共74 kb。试验表明,在单倍体酵母菌中利用该系统可以实现DNA大片段的叠加敲除。4.酿酒酵母双倍体基因编辑Cas9/sgRNA质粒构建利用无缝克隆技术构建了可以在双倍体酿酒酵母中行使功能的Cas9/sgRNA质粒,命名为pCRCTG418。以酿酒酵母双倍体菌株W303为供试菌株,针对ade2基因设计和构建了靶点序列与同源修复模板,成功实现了7 bp缺失突变。该突变株表现为腺嘌呤营养缺陷型,在无腺嘌呤的培养基中无法正常生长。试验表明,pCRCTG418质粒可以应用于酿酒酵母双倍体基因组的编辑。
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