蜘蛛结网、家蚕吐丝、黄蜂筑巢,动物的泌丝行为在自然界广泛存在;或为猎食、或为防御、或为繁殖,多种多样的泌丝行为已经成为蜘蛛、昆虫等数十万种动物生存和繁衍的重要手段。在自然界中,存在着超过85万种动物丝,有超过20万种鳞翅目(Lepidoptera)昆虫及3万余种蜘蛛可以泌丝。其中,鳞翅目昆虫由蝶类昆虫,即锤角亚目(Rhopalocera),和蛾类昆虫,即异角亚目(Heterocera)组成。有证据表明,蝶类昆虫与其他鳞翅目昆虫一样具有泌丝能力,但目前关于鳞翅目昆虫丝的研究仅集中在与家蚕亲缘关系较近的蚕蛾科(Bombycidae)和大蚕蛾科(Saturniidae)的一些昆虫间。对于蝶类昆虫的泌丝现象和蝴蝶丝的研究,还未见报道。蜘蛛和家蚕是泌丝动物的典型代表。蜘蛛丝具有优异的综合力学性能,集高韧性与高强度与一体,即使是最优秀的人造纤维,其综合力学性能依旧难以与蜘蛛丝相比。家蚕丝的优点是产量大,特别是经过了五千多年的人工驯养,家蚕合成丝蛋白的效率在整个自然界都无可匹敌。有趣的是,蜘蛛丝蛋白和家蚕丝蛋白虽然具有独立的起源,但是却在结构上具有非常相似的特征。基于宏观和微观尺度的研究发现,蚕丝和蜘蛛丝都是由晶体区域嵌入无定形蛋白质基质区域所形成的一种半结晶纤维材料。其中,晶区主要是反向平行排列的β-折叠结构,提供了丝纤维的强度和弹性模量;无定形蛋白质基质区域主要是无规卷曲和螺旋结构,提供了丝纤维的延展性;晶区和无定型区进一步组装,形成纳米纤维束,最终组成整个丝纤维,这种层层递进的多层级结构正是蜘蛛丝与蚕丝力学性能优异的原因所在。而影响丝蛋白结构和成丝性能的根本原因,还是丝蛋白本身的序列,即氨基酸组成与排列顺序。和其它蛋白相比,丝蛋白基因的进化相对较快,特别是丝素蛋白重链的重复序列区。昆虫丝蛋白编码基因过高的突变率,导致了它们序列组成的快速分化,造就了鳞翅目昆虫丝蛋白序列丰富的多样性。迄今为止,已报道序列的鳞翅目昆虫仅有家蚕(Bombyx mori)、柞蚕(,Antheraea pernyi)、蓖麻蚕(Attacus cynthia ricini Boisduval)等少数几个吐丝量较高的物种,但据我们所知,绝大多数的鳞翅目昆虫都可以吐丝。因此,基于以上的背景分析,我们收集了7种蝶类昆虫的丝和近30种蛾类昆虫的丝,并对丝蛋白结构和丝的力学性能开展了比较研究。同时,为了研究丝蛋白序列对其性能产生的影响,我们简化了研究模型,使用不同鳞翅目昆虫的丝蛋白序列进行真核表达并进行人工纺丝,以此来解析单纯的序列差异对最终成丝的结构和性能的影响。主要研究结果如下:1.鳞翅目蝶类昆虫的丝我们首先收集了枯叶蛱蝶(Kallima inachus Swinhoe)、红锯蛱蝶(Cethosia biblis)、青斑蝶(Tirumala limniace)、金斑蝶(Danaus chrysippus)、大帛斑蝶(Idea leuconoe)、达摩凤蝶(Papilio demoleus Linnaeus)、玉带凤蝶(Papilio polytes),共7种来自2总科7科属的蝴蝶幼虫和蛹。根据其不同的结蛹方式,将其分为悬蛹和缢蛹两类。其中悬蛹多见于蛱蝶科(Nymphalidae)、眼蝶科(Satyridae)、斑蝶科(Danaidae)等,缢蛹则多见于常见于凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、小灰蝶科(Riodininae)等。悬蛹和缢蛹对丝的使用方式既有相同之处又存在一些差别。相同的是,它们的尾部都有臀棘可以与幼虫分泌织造的丝垫钩合在一起用于固定蛹体,臀棘上的倒钩和丝垫以类似魔术贴的方式相互勾连固定。缢蛹的特殊之处在于缢丝,缢丝是由幼虫分泌的8-12根单丝经过缠绕形成的一种类似钢丝绳的结构,与丝垫相连接,穿过胸部表皮,用于固定蛹体的上半部分。构成缢丝和丝垫的丝在成分上并没有本质区别,但是多股缢丝呈螺旋状缠绕组装在一起后,极大地提高了缢丝的综合力学性能。2.鳞翅目蝴蝶丝与蛾类丝的成分、结构与性能比较除了上述的7种蝴蝶丝以外,我们利用相机、解剖镜、扫描电子显微镜,对收集到的各种鳞翅目昆虫茧和丝进行形态学比较研究。发现鳞翅目蛾类昆虫的茧层形态主要可以分为:质密多孔结构和连续丝胶膜粘连形成的片状结构两类。茧层的具体差异体现在丝胶的连续性、茧层孔隙大小、有无非丝成分和草酸盐含量等方面。对5种蛾类昆虫茧的研究结果表明,家蚕、野桑蚕的茧层为孔隙较小的质密多孔结构,茧层成分较为均一,未见非丝蛋白成分。茶蚕是蚕蛾科昆虫,在分类学中与家蚕有较近的亲缘关系,其茧层形成了连续的丝胶膜,茧层成分均一,表面可见少量草酸钙晶体。樟蚕为大蚕蛾科昆虫,茧的形状较大,茧层形成连续的丝胶膜,茧丝表面可见大量的草酸钙晶体。大蓑蛾是蓑蛾科昆虫,其特征是幼虫全龄期覆茧营生,其茧层为孔隙较大的质密多孔结构,茧层成分包含枝叶、泥土等环境成分,茧层中草酸钙含量较少。进一步研究中,我们利用静态拉伸实验和傅里叶变换红外光谱技术(FTIR)比较了3种蚕蛾科昆虫丝和3种蝴蝶丝的力学性能与丝蛋白二级结构的差异。结果显示,3种蝴蝶丝的综合力学明显性能均低于3种蚕丝,蚕丝的断裂强度在400MPa以上,但蝴蝶丝的断裂强度仅有其一半左右。在延展性方面,3种蚕丝的延展性为18-20%,而3种蝴蝶丝仅为10-13%。韧度方面,蚕丝则更是远超蝴蝶丝,其差异可达6-10倍。丝蛋白的二级结构检测结果表明,6种鳞翅目昆虫丝的红外光谱均显示出蛋白质基质材料的特征,在酰胺I、酰胺II、酰胺III区域存在明显的吸收峰,且金斑蝶丝的草酸钙吸收峰非常明显。对酰胺III区域进行去卷积分析,结果显示,相对于3种蚕丝35-38%的β-折叠含量来说,蝴蝶丝中的β-折叠含量显著低于蚕丝。这一结果与力学性能测试结果中断裂强度的规律相符合,二者呈现明显的正相关性。因此,我们推测,因为蝶类丝含有更少的β-折叠结构,所以导致了其断裂强度低于蚕蛾丝。3.鳞翅目昆虫丝素重链蛋白的真核表达与人工纺丝为了分析丝蛋白序列对成丝性能的影响,我们构建了简单的实验方法模型。根据物种的进化程度,从已报道的鳞翅目昆虫丝素重链蛋白序列中选出5种作为备选。并在其丝素蛋白重复区中截取单个重复单元,经过相应的重复次数,使所得重组蛋白的分子量均为50 k Da左右。接着,根据所设计的蛋白序列,配合巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)的优势表达密码子库,利用p PICZαA载体,得到4种蛋白的表达菌株,并进行大量表达和纯化。最终成功获得2种鳞翅目昆虫丝素蛋白的重组蛋白:以日本蓑蛾的丝素重链重复区序列为基础的E.variegate Fb H-RP和以金凤蝶丝素重链重复区序列为基础的P.machaon Fb H-RP。将两种重组蛋白溶解于六氟异丙醇(HFIP)中,制成约10-20%(w/v)的纺丝原液,利用湿法纺丝技术,控制相同的纺丝条件,进行人工纺丝。所得的初生丝纤维经过4倍后拉伸后,形成两种质地均匀的湿纺成丝:E.variegate RP-WF和P.machaon RP-WF。对所得丝纤维进行力学性能和二级结构的检测,结果表明,两种湿纺成丝的综合力学性能存在明显差异:E.variegate RP-WF的断裂强度为67.66 MPa,伸长率为2.87%;P.machaon RP-WF的断裂强度为36.14 MPa,伸长率为3.26%。结合红外光谱的分析结果,发现两种重组蛋白湿纺成丝的β-折叠结构含量分别为10.3%和6.6%,证实其丝性能确实与β-折叠结构含量有关。通过对比此前根据氨基酸序列所预测的蛋白质二级结构含量分析结果,推测序列中存在的寡聚丙氨酸嵌段(poly alanine block)和(GA)_n结构是影响β-折叠含量和丝性能的主要原因。