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坛紫菜(Porphyraaitanensis)是我国南方沿海人工养殖的经济海藻主要品种之一,资源丰富。坛紫菜含有丰富的藻红蛋白(phycoerythrin、PE),可用于大量制备PE的原料。近年来,已有学者对坛紫菜藻红蛋白提取、分离纯化、结构和抗氧化活性等作了一些研究,但目前藻红蛋白的生理活性研究还很不够,尤其是其抗肿瘤活性未见报道。本论文对产于广东汕头南澳海区坛紫菜中的藻红蛋白进行了以下研究: (1)藻红蛋白提取分离采用反复冻融法破碎藻体细胞,25%~50%饱和度硫酸铵二步盐析沉淀藻红蛋白得粗提物,利用两步柱层析对藻红蛋白粗提物进行分离纯化,即先过sephadexG-100层析柱再过DEAE-cellulose柱层析。在此条件下分离得到的藻红蛋白纯度(A565/A280)达3.3,藻红蛋白得率为1.68mg/g干坛紫菜。 (2)藻红蛋白组成结构分析SDS-PAGE电泳分析显示:坛紫菜藻红蛋白有α、β、γ三个亚基,分子量分别为18KDa、23KDa和33KDa;紫外光谱及荧光发射光谱分析可见藻红蛋白在490nm、532及570nm处有吸收峰,最大吸收峰为565nm,据此判断该藻红蛋白为R型藻红蛋白(R-PE),与有关文献报道的一致。 (3)体外抗肿瘤作用及机理利用MTT比色法探讨了R-PE光动力治疗(Phtodyna-mictherapy,PDT)对人宫颈癌Hela细胞的影响。结果表明:R-PE结合PDT(简称R-PE+PDT)处理能够显著增强R-PE对Hela细胞的杀伤作用,60μg/mL的R-PE+PDT处理24h对Hela细胞的抑制率达81.4%,在此处理条件下人正常内皮细胞生长几乎不受影响。利用AnnexinV-FITC/PI双荧光染色法检测了经R-PE+PDT处理的Hela细胞,结果表明,在剂量为0~60μg/mL范围内,随着R-PE剂量的增加,凋亡细胞和凋亡晚期细胞或坏死细胞随之增多,提示R-PE可诱导Hela细胞的凋亡,而PDT处理可以加强这一作用。DNAladder电泳结果显示:经R-PE+PDT处理Hela细胞,Hela细胞基因组DNA在100~400bp出现坏死解散的弥散条带。QRT-PCR检测发现,与空白组比较,R-PE能够显著提高Hela细胞中caspase-3、caspase-10基因表达水平、下调抗凋亡蛋白基因Bcl-2表达水平诱导细胞凋亡,从而抑制Hela细胞的生长。 (4)体外抗氧化实验检测了R-PE对DPPH·自由基的清除作用,当2.5mg/mLR-PE(纯度2.45)时对DPPH·清除率达89.4%,明显高于对照物维生素C。 (5)利用小鼠S180肿瘤模型,研究了R-PE体内抗肿瘤作用及其机理。R-PE溶液经口灌胃,当给药剂量为300mg/kg·d时,抑瘤率达到41.3%。对荷瘤小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的测定结果表明,R-PE能提高机体抗氧化能力;免疫作用研究发现,R-PE对荷瘤小鼠胸腺、脾脏等免疫器官有很好的保护作用,能提高荷瘤小鼠脾淋巴细胞对ConA的增殖反应,增强荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性,并能促进血清中肿瘤坏死因子TNF-α的分泌。以上结果提示,坛紫菜藻红蛋白可以通过增强S180荷瘤小鼠的免疫力和抗氧化能力,促进肿瘤细胞中促凋亡蛋白酶基因表达和肿瘤坏死因子的分泌等多途径发挥其抗肿瘤作用。