心肌肥厚、心衰常常伴发心律失常,特别是心衰时严重的室性心律失常致心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)的发生率大大提高,成为心血管病死亡的主要原因。最新资料显示我国SCD发生率平均为41.84例/10万人,以13亿人口推算,SCD高达54.4万例/年,居各国之首。自从1998年Molkentin等提出细胞内Ca2+i/CaM/Calcineurin/NFAT信号传导通路的激活是产生病理性心肌肥厚和心衰的重要机制以来,越来越多的实验发现这条钙信号通路的激活亦是造成病理情况下心肌细胞电生理重构的原因。我们小组前期实验表明,在小鼠心肌肥厚,心衰发展过程中动作电位(AP)延长形式不同,心肌肥厚阶段外膜下细胞APD延长超过内膜下细胞,AP跨壁复极梯度消失;而心衰期主要的变化是内膜AP的延长,造成内、外膜下心肌细胞复极离散度增大。应用Calcineurin抑制剂环孢素A(CsA)后,明显上调了左心室内膜下和外膜下细胞Ito,Ikslow,Iss的水平,缩短了内膜下细胞APD,心衰心脏增大的AP跨壁异质性得到了部分逆转,即异质性减小(见师晨霞博士论文)。那么心肌肥厚阶段AP跨壁异质性减少是否也和CaN通路有关?心肌肥厚、心衰是个动态发展的过程,我们推测在不同的肥厚模型,甚至同一模型的不同阶段,该信号通路活性、致肥厚作用和对心脏电生理特性的影响可能并不完全相同。本实验拟在压力超负荷小鼠心肌肥厚、心衰模型上,应用环孢素A(CsA),阻断Calcineurin信号通路,通过测定心脏血流动力学及膜片钳技术记录左室游离壁内、外膜下细胞AP和ICa-L的跨壁变化,试图评价这条通路在心肌肥厚、心衰发展过程中对心脏的功能和电生理特性的影响是否相同。第一部分钙调神经磷酸酶抑制剂对小鼠压力超负荷性心肌肥厚、心衰模型血流动力学的影响目的:采用压力超负荷小鼠心肌肥厚、心衰模型,通过整体模型给予CaN特异性抑制剂CsA,试图评价这条通路在心肌肥厚、心衰发展过程中对心脏功能所起的作用是否相同。方法:(1)动物模型的制备:将4周龄,体重(20±2)g的小鼠麻醉后开胸,对主动脉弓进行结扎,致主动脉弓狭窄65%-70%,使左室后负荷增加,建立压力超负荷性心肌肥厚、心衰模型。(2)实验分组:选取术后5周、11周分别作为肥厚期、心衰期的考察点。分别于术后第3周、第9周皮下注射CsA,25mg/kg,2次/天,持续2周,即Band5w+CsA、Band5w+Veh、Band11w+CsA、Band11w+Veh组。为了进一步说明CsA对于正常和病理状态下心脏作用的选择性,在Sham组中设与Band组同期的治疗组和溶剂对照组,即Sham5w+Veh、Sham5w+CsA、Sham11w+Veh和Sham11w+CsA组。(3)对于手术各组分别检测体重、摄食量、心质量指数、肺质量指数、血流动力学参数:SBP、LVSP、LVEDP、dp/dt max、dp/dt min,并与同期假手术各组进行比较。结果:(1)5周各组动物一般状态较好,无死亡,体重、摄食量均无显著性差异。与同时期Sham组相比,Band11w+Veh和Band11w+CsA组动物体重和摄食量明显减少(P <0.01)。(2)同Sham5w+Veh组相比,Band5w+Veh组心室重量、心质量指数、肺脏重量、肺质量指数均显著性增加(P <0.01);而Sham5w+CsA组各参数无显著性改变。与Band5w+Veh组相比,Band5w+CsA组心室重量、心质量指数、肺脏重量、肺质量指数均有显著减少(P <0.01),但是没有减少到Sham5w+Veh组水平。同Sham11w+Veh组相比,Band11w+Veh组心室重量、心质量指数、肺脏重量、肺质量指数均有显著性增加(P <0.01);而Sham11w+CsA组各参数无显著性改变(P >0.05)。与Band11w+Veh组相比,Band11w+CsA心室重量、心质量指数、肺脏重量、肺质量指数无显著性差异,仍显著高于Sham11w+Veh组。与Band5w +Veh组相比, Band11w+Veh组和Band11w+CsA组的心室重量、心质量指数均显著下降(P <0.05),肺脏重量、肺质量指数无显著性改变。(3)各组心率无显著性差异。同Sham5w+Veh组相比, Band5w+Veh组SBP、LVSP、LVEDP、dp/dt max、dp/dt min均显著性增加(P <0.01)。与Band5w+Veh组相比,Band5w+CsA组SBP、LVSP、LVEDP、dp/dt max、dp/dt min均显著性减少(P <0.05或P <0.01),但是没有减少到Sham5w+Veh组水平。Sham5w+CsA组与Sham5w+Veh组相比没有显著性差异。同Sham11w+Veh组相比,Band11w+Veh组SBP、LVSP、LVEDP显著性增加(P <0.05),而dp/dt max和dp/dt min降低(P <0.05)。与Band11w+Veh组相比,Band11w+CsA组SBP、LVSP、LVEDP、dp/dt max和dp/dt min均无显著性差异,仍显著高于或低于Sham11w+Veh组(P <0.05)。Sham11w+CsA组与Sham11w+Veh组相比没有显著性差异。与Band5w +Veh组相比,Band11w+Veh组和Band11w+CsA组SBP、LVSP、dp/dt max、dp/dt min均显著下降(P <0.05),LVEDP显著增加(P <0.01)。结论:Calcineurin信号通路激活是致心肌肥厚的重要途径,抑制该通路可以使肥厚期心脏的功能得以部分逆转。第二部分钙调神经磷酸酶抑制剂对心肌肥厚小鼠左心室跨壁动作电位的调节目的:采用打孔膜片钳技术,应用环孢素A(CsA),阻断Calcineurin信号通路,观察小鼠压力超负荷性心肌肥厚左室游离壁心内膜下、心外膜下心室肌细胞动作电位跨壁异质性的变化。方法:以第一部分中肥厚期动物为考察对象,于术后第3周皮下注射CsA,25mg/kg,2次/天,持续2周,即Band5w+CsA、Band5w+Veh。在Sham组中设与Band组同期的治疗组和溶剂对照组,即Sham5w+Veh、Sham5w+CsA。利用酶解法分离得到各组小鼠左室游离壁内、外膜下心肌细胞。采用打孔式膜片钳技术记录单个心肌细胞的动作电位,计算动作电位复极达50%的时程(APD50)和动作电位复极达90%的时程(APD90)。结果:(1)Sham5w+Veh组和Sham5w+CsA组动物左室游离壁内、外膜下细胞AP形态和APD存在着明显的差异,内膜APD明显长于外膜。与Sham5w+Veh组相比,Sham5w+CsA组动物APD50,APD90没有显著性差异。(2)主动脉部分狭窄5w时,Band5w+Veh组(术后3w皮下注射NaCl)小鼠外膜下细胞APD50,APD90明显延长,与同时期的Sham5w+Veh组相比,延长了23%和185%(P<0.01),而内膜下细胞仅APD50延长了30%(P<0.05),APD90没有改变,即动作电位异质性明显减小。(3)与同时期的Band5w+Veh组动物相比,Band 5w+CsA组动物外膜下细胞APD50没有改变,但APD90明显缩短,缩短了24%(P<0.05),没有恢复到Sham5w+Veh组水平;内膜下细胞APD50,APD90没有改变,即给CsA后,心肌肥厚小鼠的左心室跨壁动作电位异质性增大,但没有恢复到正常水平。结论:Calcineurin信号通路激活是造成肥厚期APD异质性减小的主要原因。阻断该通路,有助于恢复正常的AP跨壁异质性。第三部分钙调神经磷酸酶抑制剂对压力负荷性心肌肥厚、心衰小鼠左心室跨壁L-型钙电流的调节目的:采用全细胞膜片钳技术,通过应用Calcineurin的特异性抑制剂环孢素A(CsA),阻断Calcineurin信号通路,观察压力负荷性心肌肥厚、心衰时,小鼠左心室心内、外膜下细胞ICa-L的改变。方法:继续以第一部分中分组因素为考察点,利用酶解法分离得到各组小鼠左室游离壁内、外膜下心肌细胞。观察压力负荷性心肌肥厚、心衰时,小鼠左心室心内、外膜下细胞ICa-L的改变。结果:(1)与同时期的Sham+Veh组相比,Sham5w+CsA组和Sham11w+CsA组细胞电容没有区别。Band5w+Veh组心内、外膜下细胞电容明显增大,分别增加46.7%和42.9%(P<0.01),Band11w+Veh组心内、外膜下细胞电容也分别增加61.1%和80.4%(P<0.01)。给予CsA后,与同时期的Band+Veh组相比,Band5w+CsA组心内、外膜下细胞电容明显减小,分别降低了17.7%和18.0%,(P<0.05),Band11w+Veh组心内、外膜下细胞电容也分别降低了14.1%和16.7%(P<0.05),均未减小到同时期假手术组水平。(2)Sham+Veh组和Sham+CsA组小鼠内、外膜细胞的ICa-L密度无明显差别。与同时期Sham+Veh相比,Band5w+Veh和Band11w+Veh内膜下细胞ICa-L密度显著降低(P<0.01);给予CsA后,与同时期的Band+Veh组相比,Band5w+CsA组和Band11w+CsA组ICa-L密度继续降低,在+20mV ~ +40mV的4个电压下,Band5w+CsA组ICa-L密度分别降低了25.1%、31.8%和36.5%(P<0.01或P<0.05),而在+10mV ~ +40mV的4个电压下,Band11w+CsA ICa-L密度分别降低了19.1%、23.2%、25.3%和32.3%(P<0.01或P<0.05);各组激活电位、峰电位和翻转电位没有改变。而与同期的Sham+Veh组相比,Band5w+Veh,Band5w+CsA和Band11w+Veh,Band11w+CsA外膜下细胞的ICa-L密度、激活电位、峰电位和翻转电位没有改变(P>0.05)结论:心衰期阻断Calcineurin信号通路后,内膜ICa-L密度降低,APD缩短,是此时AP跨壁异质性减少的原因之一。结论1. Calcineurin信号通路激活是致心肌肥厚的重要途径,抑制该通路可以使肥厚期心脏的功能得以部分逆转。2. Calcineurin信号通路激活是造成肥厚期APD异质性减小的主要原因。阻断该通路,有助于恢复正常的AP跨壁异质性。3.心衰期阻断Calcineurin信号通路后,内膜ICa-L密度降低,APD缩短,是此时AP跨壁异质性减少的原因之一。