随着猪人工授精技术在生猪养殖业中的广泛应用,精液保存技术迅速发展。由于猪精子结构的特殊性,目前猪精液常温保存是人工授精最常用的保存方法。众所周知,细菌污染和氧化应激是精液常温保存所面临的两大重要障碍。目前的研究表明,在稀释液中加入适当的抗氧化剂可以有效防止精子的氧化损伤,从而提高常温保存的精液品质。然而随着抗生素的禁用,新的抗生素代替策略逐渐成为了研究热点。壳聚糖具有改善动物生长性能、增强机体免疫力、调节脂肪代谢、抗菌抑菌和抗氧化等多种生物学功能,被认为是具有广泛开发前景的绿色添加剂,但壳聚糖在精液保存方面的研究较少。因此,为了提高猪精液常温保存的效果,本研究结合前期研究基础,在猪精液常温保存稀释液中添加0.1 g/L壳聚糖,检测保存1～6 d的精子活力、质膜完整性、顶体完整性等,与0.25 g/L庆大霉素和0.068 g/L维生素C进行比较,并进行16S r DNA测序分析,研究壳聚糖的抗氧化性能与抗菌性能,以期对壳聚糖作为猪精液常温保存抗氧化剂的应用提供理论依据。本研究获得的主要结果如下:1.在猪精液常温保存稀释液中分别加入0.1 g/L壳聚糖、0.25 g/L庆大霉素、0.068g/L维生素C,常温保存6 d后,三组精液的保存质量显著高于对照组(P<0.05),其中稀释液中添加庆大霉素组的保存质量显著高于其他组(P<0.05),壳聚糖组的保存质量显著高于维生素C组(P<0.05)。稀释液中添加壳聚糖保存6 d的精子活力、质膜完整率和顶体完整率分别为61.67%、68.67%、72.67%,仅次于庆大霉素组,但均显著高于对照组(P<0.05)。同时,对照组精子凋亡细胞占比最高,稀释液中添加0.1 g/L的壳聚糖组和0.068 g/L的维生素C组的精子凋亡细胞占比仅次于对照组,而添加0.25g/L庆大霉素组的精子凋亡细胞占比最低。因此,稀释液中添加0.1 g/L的壳聚糖可达到庆大霉素等传统添加剂的效果,精子有效保存时间可达到6 d。2.在猪精液常温保存稀释液中添加0.1 g/L壳聚糖、0.25 g/L庆大霉素、0.068 g/L维生素C,对常温保存6 d后精子的相关抗氧化酶及凋亡情况进行检测发现,稀释液中添加0.1 g/L壳聚糖和维生素C组精子的T-AOC活性、GSH活性、SOD活性和CAT活性显著高于庆大霉素组和对照组(P<0.05),而MDA含量和ROS水平显著低于庆大霉素组和对照组(P<0.05)。虽然稀释液中添加0.1 g/L壳聚糖组和维生素C组之间差异不显著(P>0.05),但0.1 g/L壳聚糖组的精子T-AOC活性、GSH活性、SOD活性和CAT活性高于维生素C组,MDA含量和ROS水平低于维生素C组,稀释液中添加0.1 g/L壳聚糖组的保存效果显著优于对照组和庆大霉素组(P<0.05)。因此,在稀释液中添加0.1 g/L壳聚糖组的保存效果最佳,显著提升了精子的抗氧化性能。3.本研究分别从门、目、属三个水平上的微生物组成的变化来分析精液中微生物的种类及分布情况,发现精液中在门水平上占据主导地位的细菌主要包括变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes);在纲水平上占据主导地位的细菌主要包括γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)和α-变形菌纲(Gammaproteobacteria);在目水平上的优势菌种为肠杆菌目(Enterobacteriales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)和梭菌目(Clostridiales),其中最为优势的是肠杆菌目,占总变形菌门的60%～80%。本研究结果表明稀释液中添加壳聚糖组和庆大霉素组精液中变形菌门(Proteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)和沙雷氏菌属(Serratia)等的丰度显著低于其他组(P<0.05)。精液保存5 d后,16S r DNA测序结果表示稀释液中添加0.25 g/L庆大霉素和0.1 g/L壳聚糖相对于对照组来说变形菌门的含量显著下降(P<0.05),其中肠杆菌目和假单胞杆菌目的含量也相应下降,但有部分菌属的含量也有所上升,表明壳聚糖有类似庆大霉素的抗菌作用,且只对部分菌属有抑制作用。因此,本研究结果表明在猪精液常温保存稀释液中添加0.1 g/L壳聚糖能够显著提高精子常温保存后的精子活力、质膜完整率和顶体完整率、T-AOC、SOD、GSH和CAT活性,并显著降低MDA含量和ROS水平,且抗菌效果达到庆大霉素等传统抗生素的效果,表明在一定程度上可替代抗生素的使用,壳聚糖既具有抗氧化性能,又具有一定的抑菌性能,对于猪精液常温保存的研究具有重要意义。