慢性粒细胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia,CML)是获得性造血干细胞恶性克隆性疾病,为我国最常见的一种慢性白血病,约占成人白血病的15%~20%。临床分期包括慢性期(Chronic Phase,CP)、加速期(Accelerated Phase,AP)和急变期(Blastic Phase,BP)。加速期和急变期被认为是疾病进展期。t(9;22)(q34;q11)易位形成Ph染色体并导致BCR/ABL融合基因的形成,其编码的P210BCR/ABL蛋白具有极强的酪氨酸激酶活性,使一系列信号蛋白发生持续磷酸化,影响细胞的增殖、分化及凋亡,是CML发病的分子基础。尽管10余年来酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)极大改善了CML患者的预后。但随着临床应用范围的扩大和时间的推移,一些患者出现耐药及疾病进展,治疗效果差,死亡率极高。为克服这一难题,人们积极寻找新的治疗靶标及联合应用其他药物。肿瘤发生与原癌基因激活和抑癌基因失活有关。抑癌基因失活受遗传学和表观遗传学的调控。表观遗传学(epigenetic)指DNA序列不发生变化而基因表达发生可遗传的改变,并在细胞发育和增殖过程中能够稳定传递,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑及RNA干扰等。抑癌基因PTPN6(又名SHP-1)属胞浆蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatases,PTPs)家族,在细胞信号转导中起负调控作用,与肿瘤的形成及生长负相关。已有研究发现PTPN6基因启动子甲基化导致其在CML患者中低表达。抑癌基因的甲基化和组蛋白修饰,是肿瘤细胞最常见的表观遗传学调控方式,与肿瘤发生、发展密切相关。启动子甲基化可直接阻碍转录因子与启动子结合,抑制基因转录。组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyhransferase,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)共同调控组蛋白的乙酰化修饰。HDACs通过减低组蛋白乙酰化水平,使染色质结构紧缩,阻碍转录因子与DNA的结合,从而抑制转录,影响细胞分化、凋亡。本课题旨在通过对PTPN6基因与CML进展的关系、以及甲基化和组蛋白去乙酰化对PTPN6的调控作用及机制的研究,为攻克CML进展提供新思路。本研究论文分为三部分:第一部分:慢性粒细胞白血病患者PTPN6基因异常甲基化调控机制的研究目的:检测CML患者中PTPN6基因启动子区甲基化状态,及PTPN6、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、Me CP2、MBD2和HDAC1基因m RNA和蛋白水平表达情况,探讨PTPN6基因与CML进展的关系及甲基化和组蛋白去乙酰化对其的调控作用。方法:44例2014年9月~2016年6月在河北医科大学第二医院血液科和儿科就诊的CML患者按疾病分期分为三组,10例健康志愿者或营养性贫血患者为对照组(Normal Control,NC)。收集骨髓液或外周血后,提取单个核细胞。MSP法检测PTPN6基因启动子区Cp G岛的甲基化状态,PCR和Western Blot检测PTPN6、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、Me CP2、MBD2和HDAC1基因m RNA及蛋白的表达。结果:1 CML患者PTPN6基因启动子甲基化情况NC组未检测到甲基化。20例CML-CP患者中5例检测到甲基化,阳性率为25%;24例CML进展期患者(包括14例CML-AP和10例CML-BP)均检测到甲基化。CML进展期患者启动子甲基化阳性率较NC组及CML-CP组明显增高,差异有统计学意义,P<0.01;NC组与CML-CP组比较差异无统计学意义,P=0.14。2 CML患者各基因m RNA水平的表达情况DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1 m RNA在CML各期患者的表达量高于NC组,PTPN6 m RNA表达量低于NC组,差异有统计学意义,P<0.05;DNMT3b m RNA较NC组差异无统计学意义,P>0.05。其中,DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1 m RNA表达量在CML-BP组最高,差异有统计学意义,P<0.05。PTPN6 m RNA表达量在CML-CP组最高,差异有统计学意义,P<0.05,CML-AP与CML-BP组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。3 CML患者各基因蛋白水平的表达情况DNMT1蛋白在NC组低表达,在CML患者组高表达,差异有统计学意义(P<0.05),各期患者间的表达量无统计学差异(P>0.05);DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1蛋白在NC组低表达,在CML患者组高表达,CML-BP组最高,差异有统计学意义(P<0.05)。PTPN6蛋白在NC组高表达,在CML患者组低表达,CML-BP组表达量最低,差异有统计学意义(P<0.05)。DNMT3b蛋白水平在NC组和CML患者组中无显著统计学差异,P>0.05。结论:CML进展期患者PTPN6基因低表达,与其启动子区高甲基化有关,可能受DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1基因的调控。第二部分:去甲基化药物和组蛋白去乙酰化酶抑制剂对K562细胞、KCL22细胞中PTPN6基因的作用及机制目的:去甲基化药物和组蛋白去乙酰化酶抑制剂分别处理K562和KCL22细胞后,检测PTPN6基因甲基化变化,PTPN6、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、Me CP2、MBD2和HDAC1基因m RNA及蛋白水平表达量变化,探讨甲基化和组蛋白修饰对CML急变细胞系中PTPN6基因调控作用机制。方法:不同浓度去甲基化药物(Decitabine和5-Azacytidine)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂[(valproic acid,VPA)和LBH589]处理KCL22细胞和K562细胞后,亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)检测PTPN6基因启动子区Cp G岛的甲基化变化,PCR和Western Blot检测PTPN6、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、Me CP2、MBD2和HDAC1基因m RNA及蛋白表达及变化情况。结果:1 BSP法检测PTPN6基因启动子甲基化情况在K562细胞中,药物处理前PTPN6基因启动子甲基化Cp G为80.9%。VPA处理后为56.4%,差异有统计学意义,P<0.05。LBH589处理后为80.9%,5-Azacytidine为78.2%,Decitabine为81.8%。这三组与处理前比较差异无统计学意义(P>0.05)。在KCL22细胞中,药物处理前PTPN6基因启动子甲基化Cp G为85.5%。VPA处理后为66.4%,Decitabine处理后为72.7%,这两组均较处理前差异有统计学意义(P<0.05),但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。LBH589处理后为82.7%,5-Azacytidine为77.3%,这两组与处理前比较差异无统计学意义(P>0.05)。2药物处理细胞后各基因m RNA的表达变化1)VPA处理细胞后m RNA的表达变化在K562细胞中,药物处理后,DNMT1、Me CP2和MBD2 m RNA表达量明显下降,PTPN6 m RNA表达量明显升高,高浓度组最显著,差异有统计学意义,P<0.05。DNMT3a和HDAC1 m RNA明显下降,低浓度组与中、高浓度组差异有统计学意义,P<0.05,中浓度和高浓度组间无统计学差异(P>0.05)。DNMT3b m RNA表达量在药物处理前后差异无统计学意义(P>0.05)。在KCL22细胞中,药物处理后,DNMT1、DNMT3a和HDAC1 m RNA表达量明显下降,PTPN6 m RNA表达量明显升高,高浓度组最显著,差异有统计学意义,P<0.05。MBD2 m RNA表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05),但各浓度组间差异无统计学意义(P>0.05)。DNMT3b和Me CP2 m RNA表达量在药物处理前后差异无统计学意义(P>0.05)。2)LBH589处理细胞后m RNA的变化情况在K562细胞中,药物处理后,DNMT3a、Me CP2和HDAC1 m RNA表达量明显下降,PTPN6 m RNA表达量明显升高,高浓度组最显著,差异有统计学意义,P<0.05。DNMT1和MBD2 m RNA表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),但各浓度组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。DNMT3b m RNA表达量在药物处理前后差异无统计学意义(P>0.05)。在KCL22细胞中,药物处理后,DNMT1和MBD2 m RNA表达量明显下降,PTPN6 m RNA表达量明显升高,高浓度组最显著,差异有统计学意义,P<0.05。HDAC1 m RNA表达量下降(P<0.05),但各浓度组间差异无统计学意义(P>0.05)。DNMT3a、DNMT3b和Me CP2 m RNA表达量在药物处理前后差异无统计学意义(P>0.05)。3)5-Azacytidine处理细胞后m RNA的变化情况在K562细胞中,药物处理后,Me CP2、MBD2和HDAC1 m RNA表达量明显下降,PTPN6 m RNA表达量明显升高,高浓度组最显著,差异有统计学意义,P<0.05。DNMT1和DNMT3a m RNA表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),但各浓度组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。DNMT3b m RNA表达量在药物处理前后差异无统计学意义(P>0.05)。在KCL22细胞中,药物处理后,DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1 m RNA表达量明显下降,PTPN6 m RNA表达量明显升高,高浓度组最显著,差异有统计学意义,P<0.05。DNMT3b m RNA表达量在药物处理前后差异无统计学意义(P>0.05)。4)Decitabine处理细胞后m RNA的变化情况在K562细胞中,药物处理后,DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1m RNA表达量明显下降,PTPN6 m RNA表达量明显升高,高浓度组最显著,差异有统计学意义,P<0.05。DNMT1 m RNA表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),但各浓度组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。DNMT3b m RNA表达量在药物处理前后差异无统计学意义(P>0.05)。在KCL22细胞中,药物处理后,DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1 m RNA表达量明显下降,PTPN6 m RNA表达量明显升高,高浓度组最显著,差异有统计学意义,P<0.05。DNMT3b m RNA表达量在药物处理前后差异无统计学意义(P>0.05)。3药物处理细胞后各基因蛋白水平的表达情况在K562和KCL22细胞中,药物处理后,DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),PTPN6蛋白表达量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),DNMT3b蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。在K562细胞中,VPA和5-Azacytidine处理后,DNMT3a和MBD2蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),但这两药物间比较差异无统计学意义(P>0.05)。5-Azacytidine处理后,Me CP2蛋白下降最明显,差异有统计学意义(P<0.05)。VPA处理后,PTPN6蛋白增加量最少,其他三组均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),但这三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。在KCL22细胞中,5-Azacytidine和Decitabine处理后,Me CP2和MBD2蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),但这两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。5-Azacytidine处理后,DNMT3a和HDAC1蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。LBH589和Decitabine处理后,PTPN6蛋白表达量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),但这两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1在CML急变细胞株KCL22和K562中,PTPN6基因启动子高甲基化,表达量低,可能与DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1基因有关。2应用去甲基化药物和组蛋白去乙酰化酶抑制剂后,PTPN6基因甲基化程度降低,表达量增加,DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1的表达量也降低。3去甲基化药物有组蛋白去乙酰化酶抑制剂作用,组蛋白去乙酰化酶抑制剂也有去甲基化作用。5-Azacytidine显示出较强的组蛋白去乙酰化酶抑制剂作用,VPA显示出较强的去甲基化作用。第三部分:HDAC1对PTPN6基因调控机制的研究目的:探讨HDAC1对PTPN6基因的调控机制。方法:在KCL22细胞中,以小鼠Ig G抗体作为对照抗体,CoIP-MS检测与PTPN6蛋白结合的蛋白并质谱分析。ChIP-seq检测与HDAC1蛋白结合的基因并测序分析。结果:1 CoIP-MS结果:PTPN6抗体IP下来的样品鉴定到561个蛋白,对照抗体IP下来的样品鉴定到393个蛋白,其中有300个蛋白在PTPN6抗体IP组被单独检测出,即有300个蛋白与PTPN6蛋白相互作用。这300个蛋白中,经质谱分析确定HDAC1蛋白与PTPN6蛋白直接结合。软件分析可知富集到的蛋白主要参与细胞存活与死亡、蛋白质的合成、细胞生长和增殖、细胞功能与维护等生物过程,并与EIF2信号通路、蛋白泛素化途径及细胞周期信号通路密切相关,受CD437、RICTOR、MYC等上游因子调控,与肿瘤、组织损伤、遗传性疾病有关,恶性血液病密切相关。2 ChIP-seq结果:进行ChIP-seq测序后,平均产出27588525条原始reads,通过质控的Clean Reads为26510483,在全基因组范围进行Peak(ChIP Sequencing富集区域)扫描,得到2985个基因,包括MAPK、AKT、STAT5基因。对基因功能元件分析显示,内含子占36.7%,外显子占4.1%,上游调控元件占4.9%,下游调控元件占2%。对富集到的基因进行通路分析显示,与MAPK/ERK、PI3K/Akt/NF-κB、JAK/STAT、c-myc信号通路密切相关。结论:在CML急变细胞株KCL22中,MAPK、AKT、STAT5基因对HDAC1蛋白可能存在调控作用,HDAC1蛋白对PTPN6蛋白可能存在调控作用,具体机制正在进一步研究。总之,PTPN6基因与CML进展密切相关。在进展期CML中,PTPN6基因启动子区高甲基化,导致其表达受抑制。甲基化和组蛋白去乙酰化均参与了对PTPN6异常甲基化的调控。可能的机制是:MAPK、AKT、STAT5基因促进HDAC1转录复合物形成,通过Me CP2和MBD2的桥梁作用,使DNMT1、DNMT3a发挥作用,从而导致PTPN6基因甲基化。组蛋白去乙酰化酶抑制剂有望应用于克服CML进展的治疗中。