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目的:观察踝关节注射A型肉毒毒素(Botulinum toxin type A,BoNT/A)对佐剂性关节炎大鼠疼痛行为及脊髓中枢水平小胶质细胞激活、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响,探讨BoNT/A对佐剂性关节炎疼痛的治疗作用及可能的机制。方法:实验1.本研究随机选取80只雄性SD大鼠左踝关节腔注射50μl完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant,CFA)制作佐剂性关节炎疼痛模型,另选16只大鼠注射同等体积生理盐水作为对照,并分别于建模前1天及建模后第1、3、7、14和21天对大鼠机械痛阈和热痛阈进行测定以及应用HE染色技术观察踝关节病理变化。评估CFA造模情况。实验2.造模成功后,对大鼠左踝关节腔注射BoNT/A进行干预,并按照注射浓度不同分为1UBoNT/A组、5UBoNT/A组、10UBoNT/A组,CFA组及sham组再次注射同等体积生理盐水。实验过程中剔除造模失败或死亡的大鼠,最终以每组16只SD大鼠纳入实验。即5组分别为sham组、CFA组、1UBoNT/A组、5UBoNT/A组、10UBoNT/A组。分别于BoNT/A当天及注射给药后1、3、7、14天对各组大鼠机械痛阈和热痛阈进行测定。实验3.行为学检测完成后,5组大鼠分别采用Western blot法观察不同时间点大鼠L4-L6段脊髓中IBA-1(Ionized calcium binding adapter molecule 1,IBA-1)和磷酸化p38有丝分裂原活化蛋白激酶(P-p38MAPK)的蛋白表达水平,免疫荧光组织化学法检测脊髓背角中IBA-1和P-p38MAPK阳性细胞数变化情况,RT-PCR检测P2X4 mRNA与TNF-αmRNA含量。ELISA法检测TNF-α表达变化。分子对接技术预测BoNT/A与P2X4的相互作用。结果:1.与Sham组相比,造模后CFA组在整个观察期内机械痛撤足阈值(Paw withdrawal,PWT)和热痛阈潜伏期阈值(Paw withdrawal latency,PWL)明显降低(P<0.001)。2.与CFA组相比,注射5 U或10 U BoNT/A后3、7和14天,PWT显著增加(P<0.001),但1UBoNT/A组和CFA组差异无统计学意义(P>0.05)。同样,与CFA组相比,在第3天,第7天和第14天注射5 U或10 U BoNT/A显著上调了PWL(P<0.001)。1UBoNT/A组与CFA组之间未观察到显著差异(P>0.05)。3.Western blot结果显示与sham组相比,CFA组L4-L6脊髓节段IBA-1和P38MAPK蛋白表达增加(P<0.01)。与CFA组相比,5UBoNT/A组和10UBoNT/A组IBA-1和P38MAPK蛋白表达减少(P<0.01)。4.免疫荧光染色法结果显示与CFA组相比,5UBoNT/A组L4-L6脊髓节段IBA-1和P38MAPK阳性细胞的表达降低(P<0.01)。5.RT-PCR结果显示:与sham组相比,CFA组大鼠脊髓中的TNF-αmRNA的表达量显著增加(P<0.001),P2X4 mRNA表达量增加(P<0.01);5UBoNT/A组与CFA组相比,TNF-αm RNA、P2X4 mRNA表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。6.分子对接结果显示P2X4与BoNT/A具有高度的亲和力。结论:有效剂量的BoNT/A关节腔注射可以减轻CFA诱导的大鼠关节炎疼痛。其镇痛机制可能与BoNT/A通过P2X4-P38MAPK信号通路抑制脊髓小胶质细胞活化及TNF-α的释放有关。