【摘 要】
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天女木兰(Magnolia sieboldii K.Koch,Ms)是集观赏、药用价值于一身的木兰科落叶小乔木,种子具有深休眠特性,繁育困难。ABA(abscisic acid,ABA)受体PYR/PYL/RCARs基因家族作为ABA信号传导通路的起始组分发挥着重要的作用,对于揭开种子休眠解除的作用机制具有重要意义。本研究基于天女木兰种子转录组数据,筛选出天女木兰中5个AtPYRL同源基因(MsP
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天女木兰(Magnolia sieboldii K.Koch,Ms)是集观赏、药用价值于一身的木兰科落叶小乔木,种子具有深休眠特性,繁育困难。ABA(abscisic acid,ABA)受体PYR/PYL/RCARs基因家族作为ABA信号传导通路的起始组分发挥着重要的作用,对于揭开种子休眠解除的作用机制具有重要意义。本研究基于天女木兰种子转录组数据,筛选出天女木兰中5个AtPYRL同源基因(MsPYR/PYLs/RCAR,MsPYLs)中最具有代表性的MsPYR1基因,并以天女木兰PYR1为研究对象,利用基因克隆、实时定量PCR、蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)、亚细胞定位、遗传转化等技术,对其功能进行初步分析,为后期验证其功能打下基础,取得主要结果如下:(1)GA3处理后(4℃)层积过程中,种子内GA3含量增加,种子萌发率提高;ABA处理后(4℃)层积过程中,种子内ABA含量增加,种子萌发率降低。通过对层积过程中种子的含水量测定,绘制出天女木兰种子吸水曲线,由此确定了干种子、层积第0 d、16 d、40 d、56 d这5个关键时间点,进行后期各项试验分析。(2)通过天女木兰种子转录组数据筛选出了天女木兰5个MsPYL基因——MsPYR1、MsPYL2、MsPYL4、MsPYL8、MsPYL12,其中MsPYR1、MsPYL12在天女木兰休眠种子中表达量高于其他成员。ABA处理后(4℃)层积种子萌发率降低,MsPYLs基因家族成员呈现出三种不同的表达模式。一些基因的表达上调:MsPYR1、MsPYL2,上调程度的也存在差异,其中MsPYR1上调程度最大;有的基因的表达不受影响:MsPYL12;有的基因则受抑制:MsPYL4、MsPYL8。GA3处理后(4℃)层积种子萌发率提高,MsPYLs基因家族成员整体下调表达。综上筛选出在休眠种子中表达量较高、在休眠解除过程中对ABA最敏感的ABA受体——MsPYR1。(3)克隆了MsPYR1基因,生物信息学分析表明MsPYR1基因序列全长为618 bp,编码204个氨基酸。MsPYR1编码蛋白相对分子量为22.661 kD。具有PYR/PYL/RACR蛋白家族的结构域,其编码的氨基酸序列在不同物种进化中存在高度的保守性,与拟南芥中的AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2及AtPYL3亲缘关系最近,对ABA信号传导途径的调控可能存在共性。(4)MsPYR1在不同天女木兰组织中表达分析结果发现MsPYR1在除了芽以外的组织中均高表达。通过不同浓度ABA处理发现在设置的浓度梯度范围内,随ABA处理浓度的增加,种子的萌发率降低,MsPYR1表达量逐渐升高。通过FL、ABA、清水(CK)处理下ABA信号通路相关基因的表达模式分析发现,ABA处理下种子萌发率降低,MsABI3与MsPYR1表达量先升高再降低,而MsABI1整个过程中表达水平都相对较低。在ABA合成抑制剂FL处理下种子萌发率提高,ABA信号通路相关基因表达水平降低。通过WB实验发现ABA、FL、清水(CK)三种处理的种子在层积过程中MsPYR1表达水平与蛋白翻译水平一致。(5)MsPYR1蛋白定位在细胞质和细胞核中。为了研究MsPYR1的生物学功能,构建了pMDC32-MsPYR1植物超表达载体,并对拟南芥突变体pyr1pyl1pyl2pyl4进行遗传转化,获得了T0代种子,通过对应抗生素初步筛选得到抗性植株。
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