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伴随着经济不断发展,人们的生活水平不断提高,人们的膳食需求发生转变,对畜禽食物的需求量逐年提高,兽药残留和毒素残留也成了人们越来越关注的一个焦点。近年来,兽药滥用乱用和生物毒素的报道越来越多,兽药残留和毒素残留不仅对家畜家禽的生长繁殖不利,同时也会对人类的身体健康造成不良的影响,更有甚者,污染环境,破坏生态系统的平衡。为此,迫切的需要建立一套快速、有效的安全检测技术作为技术支撑。木实验利用分泌磺胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株提取总RNA,并反转录成cDNA。以cDNA为模板,利用兼并引物进行PCR扩增,分别获得SAs-scFv基因片段的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),并通过与pMD18-T载体连接后进行大规模测序。同时,对小鼠腹水中的单克隆抗体进行纯化后,利用木瓜蛋白酶进行水解获得Fab片段,SDS-PAGE检测后,对Fab中的VH片段和VL片段分别进行Orbitrap质谱分析,获得其氨基酸序列。将VH、VL可变区测序结果与质谱鉴定结果进行比对分析,获得了磺胺类特异性抗体可变区序列,VH可变区(VH7)长度为333 bp, VL可变区长度(VL1、VL20)为339bp和339 bp。利用重叠延伸PCR将VL可变区(VH1和VL20)分别和VH可变区(VH7)及Linker进行连接,获得了 711 bp的单链抗体(SAs-scFv)基因片段。利用限制性内切酶SfiI和NotI对SAs-scFv-pMD18-T质粒进行双酶切,并与经过相同酶切的表达载体pLIP6/GN进行连接,化转入BL21 (DE3 )感受态细胞中,在诱导条件20° C,200rpm摇床振荡培养12h,IPTG终浓度为0.05mmol/L,对表达菌株进行诱导,获得了可溶性的抗磺胺单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(SAs-scFv-AP)。利用Ni-NTA-His-Bind亲和层析柱对SAs-scFv-AP进行纯化,得到纯化后的SAs-scfv-AP。利用ELISA免疫检测试验对纯化后的SAs-scFv-AP进行检测,测得抑制率为65.45%。通过类似方法,获得了纯化后的AFB1-scfv-AP,测得抑制率为 47.47%。