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猪繁殖障碍性疫病是近年来养猪生产实践中最为普遍和突出的问题，已给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。其中猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒等在临床上多引起猪的繁殖障碍性疫病，且常呈混合或继发感染。猪群中，多病原混合感染已是发病的普遍规律，两种或其以上的病原体共同感染导致了猪群的高发病率和高死亡率，使得诊断和防治难度加大。为实现临床多病原混合感染的快速确诊，本研究建立了针对上述病原体的六重PCR鉴别诊断方法，为相关疫病病原的快速诊断和防控提供了有效的技术手段。主要研究内容如下：1、PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV六重PCR鉴别诊断方法的建立参照NCBI中PRV gE（NC006151）、PPV NS1（NC001718）、PCV2ORF2（NC005148）、PRRSV ORF7（NC001961）、CSFV E2(（X87939）、JEV E（M55506）等基因序列，应用相关软件设计了6对引物，分别用于扩增PRV gE、PPV NS1、PCV2ORF2、PRRSV ORF7、CSFV E2、JEV E基因的部分片段。单项PCR鉴别诊断方法的建立结果表明：（1）最佳反应体系：PPV、PCV2、PRRSV、JEV上下游引物各2μL（10μmol/L），PRV、CSFV上下游引物各2.5μL（15μmol/L）；模板PPV、PCV2、PRRSV、JEV各3μL，PRV、CSFV各4μL；反应体系为50μL最佳。（2）单项PCR最佳反应条件：PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV最佳退火温度分别为57.0℃、52.0℃、56℃、57℃、56.0℃、57.0℃。（3）敏感性和特异性试验结果表明：单项PCR对6种病毒的最低核酸检测量分别为PRV2.5pg、PPV7.3pg、PCV24.8pg、PRRSV3.9pg、CSFV3.8pg、JEV0.4pg，对猪流感病毒（SIV）、大肠杆菌（E.coli）的检测结果均为阴性。六重PCR鉴别诊断方法的建立结果表明：（1）最佳反应体系：PPV、PCV2、PRRSV、JEV上下游引物各1μL（10μmol/L），PRV、CSFV上下游引物各1.5μL（15μmol/L）；模板PPV、PCV2、PRRSV、JEV各1μL，PRV、CSFV各2μL；反应体系为50μL最佳；（2）多重PCR最佳反应条件：50℃40min；94℃5min；94℃30s，56.4℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min；（3）特异性和敏感性试验结果表明：该六重PCR对6种病毒的最低核酸检测量分别为PRV6.6pg、PPV96pg、PCV212.9pg、PRRSV10.5pg、CSFV51pg、JEV46pg，对猪流感病毒（SIV）、大肠杆菌（E.coli）的检测结果均为阴性。2、六重PCR诊断方法在临床样品中的应用应用该六重PCR方法，对107份临床病料检测的结果表明，PCV2感染阳性率为83.1%（89/107），感染率最高；PCV2和PRRSV混合感染阳性率达到51.4%（55/107）；PPV+PCV2+PRRSV+CSFV混合感染阳性率为4.7%（5/107）；同时也检测出PCV2与JEV、PRV与JEV、PPV、PCV2、PRRSV等不同程度的混合感染。由此可见，上述6种猪病毒性疫病在贵州省猪群中普遍存在且混合感染情况严重，本研究建立的六重PCR方法不仅实现了上述6种病毒的同时检测，更实现了DNA病毒及RNA病毒的同步检测，能够对PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV单个或混合感染的临床病料进行快速鉴别诊断。3、猪圆环病毒2型贵州株的分离鉴定及全基因序列分析实验对经六重PCR检测阳性的PCV2病料，经系列处理后分别同步接种于PK-15细胞，实现了3株PCV2病原的快速分离，并特异性扩增和克隆了分离毒株的全基因组，分离株分别为GZ-CS1株（1768bp，JQ809462）、GZ-QZ1株（1767bp，JQ809463）和GZ-RH1株（1767bp，JQ809464）。序列分析结果表明：分离株与哈兽研疫苗株（LG株）全基因组核苷酸序列相似性为95.3%～96.2%，其中GZ-QZ1和GZ-RH1与LG株存在1个碱基缺失，导致C末端氨基酸由LG株的“---LKP”变为“---LNPR”；GZ-CS1分离株与LG株之间无缺失，但存在一定的突变区域，主要集中在1160～1350基因组区域，提示在贵州省内流行的PCV2毒株之间均存在一定的变异，其变异情况是否影响其毒力和疫苗免疫尚待于进一步研究。