背景及目的：目前,心肌缺血性疾病的患病率和致死率依然非常显著。血流再灌注心肌时可防止心肌进一步梗死面积扩大,然而经过较长时间的缺血后心肌再灌注也会给带来逆转的损伤,这一现象称为缺血再灌注损伤。防治再灌注引起的心肌损伤成为心血管研究重点之一。冠状动脉多次短暂的缺血可以是心肌对随后而来较长时间的缺血耐受性增强,称为缺血预适应,能有效地保护心肌减少缺血再灌注损伤。缺血预适应分为早期保护和延迟保护两个时相,而延迟相保护出现较晚但保护时间较长,成为研究热点。众多延迟相缺血预适应保护机制得到研究阐明,然而对于其在缺血再灌注损伤中氧代谢的调节机制不甚明了。我们前期对缺血再灌注小鼠模型研究实验中,利用电子顺磁共振监测心肌内氧含量变化及激光多普勒血流监测仪监测心肌血流灌注分析发现心肌再灌注后产生超过缺血前基线Po2的高氧状态。而内皮诱导产生的一氧化氮及其衍生物调节线粒体呼吸链酶从而抑制线粒体氧消耗是其产生的重要机制之一。在本次实验中,我们将探明在小鼠心肌缺血再灌注模型中,延迟相缺血预适应是否通过调节线粒体呼吸链酶从而保护线粒体功能而改善缺血后心肌的高氧状态。实验方法：建立C57小鼠心肌缺血再灌注模型。给予冠状动脉左前降支30min缺血,60min再灌注。所有动物随机分为四组(每组6只)：(1)假手术组：开胸,不结扎干预；(2)延迟相缺血预适应组：反复结扎开放前降支3次,每次缺血5min,再灌注5min,24h后开胸假手术,不做缺血再灌注处理；(3)缺血再灌注组：左前降支结扎缺血30min,再灌60min；(4)延迟相缺血预适应治疗组：反复结扎开放前降支3次,每次缺血5min,再灌注5min,24h后开胸左前降支缺血30min,再灌60min。在缺血前,缺血中,及再灌注中利用电子顺磁共振仪监测心肌组织氧含量,利用激光多普勒血流监测仪监测心肌组织血流灌注情况；实验结束后,测量心肌缺血面积及梗死面积,检测心肌线粒体呼吸链复合体活性及蛋白表达水平,检测SODs蛋白表达水平；最后进行统计学分析。实验结果：1.缺血前和缺血中,缺血再灌注组和延迟相缺血预适应治疗组心肌氧分压无明显差异,灌注后缺血再灌注组组织氧分压明显高于缺血前基线水平形成高氧状态,延迟相缺血预适应治疗组组织氧分压维持缺血前基线水平。2.缺血前和缺血中,缺血再灌注组和延迟相缺血预适应治疗组心肌血流灌注无明显差异,灌注后缺血再灌注组组织血流明显低于缺血前基线水平,延迟相缺血预适应组组织血流维持缺血前基线水平。3.经过缺血再灌注,线粒体呼吸链复合体活性明显降低,而延迟相缺血预适应治疗可上调复合体酶活性而保护线粒体呼吸功能并可上调线粒体呼吸链复合体蛋白表达。4.延迟相缺血预适应可主动上调锰超氧化物歧化酶蛋白表达。5.延迟相缺血预适应治疗能明显减少缺血再灌注导致的心肌梗死面积。结论：延迟相缺血预适应能通过上调Mn-SOD表达及线粒体呼吸链复合体活性和蛋白表达来增加线粒体对缺血再灌注损伤的耐受性,从而抑制心肌灌注的高氧状态,保护心肌细胞,减少梗死面积。背景及目的:随着各种血流再灌注心肌的治疗方案的广泛应用,心肌梗塞进入再灌注时代,而随之产生的再灌注损伤的防治也成为研究热点。在长时间缺血后,血流再灌注前多次反复短时的缺血再灌注处理可有效降低缺血再灌注损伤,这一现象称为缺血后处理(PIOC)。由于缺血发生的时间的不确定性,缺血后处理与缺血预适应(PIC)相比有着更为广阔的临床应用前景。然而,研究表明,心肌缺血后梗死的严重程度与缺血的时间成正相关,而PIOC的保护效应在不同的缺血时间内表现不同。当缺血时间过短或者过长,PIOC的保护效果都不明显。因此我们研究目的旨在揭示不同缺血时间条件下,一从血流灌注量及心肌细胞线粒体功能方面研究血管和心肌细胞损伤情况及PIOC的保护机制,从而确定PIOC对缺血心脏保护作用的时间窗并阐明影响确定保护作用时间窗的相关机制。实验方法:野生型C57B/L6小鼠随机分为九组。(1)假手术组;()251分钟缺血再灌注组;()315分钟缺血后处理组;4()30分钟缺血再灌注组;()530分钟缺血后处理组;()654分钟缺血再灌注组;(7)54分钟缺血后处理组;(8)06分钟缺血再灌注组;(9)06分钟缺血后处理组。假手术组开胸,不做干预。缺血再灌注模型组给予冠状动脉左前降支结扎相应时间造成缺血,再开放灌注60分钟。缺血后处理模型组给予冠状动脉左前降支结扎相应时间造成缺血,随后反复结扎开放左前降支01秒缺血/10秒再灌注循环,一共3次,之后再开放灌注06分钟。体内组织氧分压采用电子顺磁共振法(EPR)测量。局部血流量采用激光多普勒血流探测技术测定。再灌06分钟后取缺血危险区心肌组织标本用于测定线粒体复合体酶(还原型烟酞胺腺嗓吟二核营酸脱氢酶(NADH一DH),墟拍酸一细胞色素C还原酶(SCR)以及细胞色素C氧化酶(CcO))活性及eNOS蛋白表达。再灌后42小时后取心脏行TTC染色用于梗死面积测定。实验结果:(1)缺血时,各操作组心肌氧分压都迅速降低至缺血时间结束。开放再灌注60分钟时,30分钟和54分钟缺血后处理组心肌组织氧分压显著低于03分钟和54分钟缺血再灌注组;51分钟缺血后处理组与15分钟缺血再灌注组氧分压无明显差异,与缺血前基线持平;06分钟缺血后处理组与60分钟缺血再灌注组氧分压无明显差异,都低于缺血前基线水平。(2)局部血流量测定显示,在03分钟,54分钟和60分钟缺血再灌注实验组中,与缺血前基线水平相比,再灌注06分钟时局部血流量随缺血时间延长而逐渐降,分别是5.3土.04,4.3士0.1和3.9士0.2(.au.)。缺血后处理可以显著改善提高30分钟和45分钟局部血流量7(.2士0.2,5.2士0.)3。而缺血后处理对06分钟缺血再灌注组血流再灌无明显改善。15分钟缺血再灌注组与巧分钟缺血后处理组无明显差异,与缺血前基线持平。(3)30分钟和45分钟缺血后处理组心肌组织线粒体酶活性明显高于03分钟和54分钟缺血再灌注组,而06分钟缺血再灌注组与60分钟缺血后处理组无明显差异。(4)缺血后梗死面积的测量表明,巧分钟缺血时在/IR组和PIOC组中均无梗死形成。与I/R组相比,IPOC可有效减少30分钟(12.4士2.2vs.32.2±0.7%)t 45分钟(21.0士1.3vs.73.9士0.7%)缺血再灌注的心脏的梗死面积,但对60分钟缺血后心脏无明显减少梗死面积的作用(464.士.2gsv45.6士3.8%)。结论:小鼠心肌缺血后处理对缺血再灌注损伤心脏的保护作用具有时间窗效应。其对缺血心肌可保护的缺血时间窗是03分钟至45分钟缺血时间。而提高局部血流量和提高心肌细胞线粒体呼吸链耗氧产能功能是决定可保护缺血时间窗的重要机制。背景及目的:急性心肌梗死经过各种再灌恢复血供的治疗抑制了梗死进一步扩大,同时也造成了新的损伤一再灌注损伤,而在其后心肌修复中心肌重构对心功能有重要的影响。一方面梗死区发生修复性纤维化,维持心脏结构,防止室壁破裂,另一方面非梗死区纤维化则使心脏顺应性降低,影响了心肌收缩和舒张功能。而如何调节心肌纤维化进程,使梗死后心肌更好恢复功能的则成为研究重点。心肌组织经过缺血再灌注,部分心肌细胞坏死形成梗死区,经过炎症过程从而发生纤维化以修复替代坏死的心肌组织形成疤痕组织。成肌纤维细胞是一种由心肌成纤维细胞转化而来,具有收缩活性的细胞,对心肌损伤的修复起重要作用。TGF一印信号通路被证明可诱导成肌纤维细胞的转化形成,而体外细胞实验证明在高氧条件下可激活TGF一pl信一号通路可增加心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。我们前期实验发现,经过急性缺血再灌注06分钟后,小鼠心肌组织氧分压明显高于缺血前出现组织高氧状态。而在eNOS基因敲除小鼠或是eNOS活性抑制剂干预小鼠经过缺血再灌注后组织的氧分压明显低于野生型小鼠,提示NeOS产生的NO是参与调节缺血再灌注产生高氧状态的重要因素。本次实验中,我们将长期监测缺血再灌注后组织氧分压变化情况,阐明心肌缺血区内成肌纤维细胞的转化机制与再灌后的组织高氧之间关系,以期揭示心肌重构调控机制,对心肌纤维化区域靶向调节提供依据。实验方法:分别建立心肌缺血再灌注和心肌组织高氧两种小鼠模型。一、建立小鼠心肌缺血再灌注模型。结扎冠状动脉左前降支03分钟,而后开放灌注3天或14天;假手术组以相同方式开胸,但不做结扎。分为六个组,每组7只:(l)C57野生型小鼠假手术组(C57sham);(2)C57野生型小鼠缺血再灌注组(C57FR);(3)eNOS基因敲除小鼠假手术组(酬05一sham);(4)eNos基因敲除小鼠缺血再灌注组(咧05一/一x/R);(5)iNOS基因敲除小鼠假手术组(iNOS一‘一sham);(6)iNOS基因敲除小鼠缺血再灌注组(NioS一-/I/R)。血流再灌注60分钟,1天,3天,5天,7天,41天利用电子顺磁共振(EPR)波谱仪连续监测心肌组织氧分压,缺血再灌注前后利用激光多普勒血流监测仪监测血流再灌注情况。灌注41天后取心肌组织切片免疫组织化学染色。灌注3天时取心肌缺血区组织用EILSA和免疫印迹法检测TeF一pl,smad,pZI和a一SMA信号。二、建立组织高氧模型。C75野生型小鼠置于59%氧气十5%二氧化碳(59%02+5%COZ)环境中处理3天,对照组处于正常空气环境中。分为四组:(1)对照组(C57sahm):正常空气环境;(2)高氧处理组(HyPeroxygentreat):95%02+5%COZ环境;(3)NO供体SNAp干预组(SNAPtreat):95%02+5%COZ环境并给以SNAP干预;(4)SOD模拟物EUK134干预组(EUK134treat):95%02+5%COZ环境并给以EUK134干预。实验结果:1.血流再灌注06分钟时,c57/lR组与Ni0s一/一FR组心肌组织都产生高氧状态,而eNOs./一FR组组织氧分压与基线持平。而在60分钟再灌后,三个组心肌组织氧都继续增加,第3天达到峰值,此时C57/IR组最高,Ni0’s八FR组次之,eNOs一/“FR组最低。而后组织氧缓慢回落,在41天时三组之间已无明显差异,都回落至基线水平。2.三种基因型小鼠经过缺血再灌注处理后第3天,心肌内活化TGF一pl}及总TGF一困都显著高于假手术组;p一Smad/23与Smda/23比值,P21和-asMA蛋白表达均高于假手术组。而eNos一/一FR组增加明显高于c57I/R组,iNOS“-/I/R组次之。3.再灌41天后小鼠心肌内a一SMA明显形成,集中于梗死带内,而eNOS一‘一I/R组和iNoS一/一I/R组明显多于C57I/R组。4.C57野生型小鼠在给予高氧环境时,心肌内氧分压明显增加,高于正常空气环境中心肌内氧分压。p一SmadZ/3/SmdaZ/3,2P1都高一于正常空气对照组,SNAp干预后降低,而EUK134干预后p一SmadZ/3/SmadZ/3降低,pZI无明显改变。结论:小鼠缺血再灌注引起的心肌组织高氧状态可诱导TGF一困一Smda信号通路增加,并上调pZI而增加a一SMA表达,促进梗死区成肌纤维细胞转化形成;而NO对高氧诱导的TGF一印激活通路产生反馈性抑制调节作用。这一机制的阐明对心肌梗死修复的干预治疗提供了新的观点和视野。