1997年O′Reilly等从鼠的血管内皮细胞瘤(EOMA)培养液中分离得到一种新的血管生成抑制因子，命名为内皮抑素(Endostain)。内皮抑素能有效抑制血管内皮细胞的增殖，进而抑制新生血管生成。由于肿瘤的发生和发展必须依赖大量的血管生成，因此，内皮抑素为肿瘤治疗提供了新的途径。目前已上市的抗癌新药恩度(Endostar)半衰期较短(约为10h)，需要每天静脉注射给药，加重了患者的经济负担。因此开发长效的内皮抑素药物显得更加重要。本研究旨在构建Endostatin与人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的融合基因EndoAlbu，表达EndoAlbu融合蛋白，可望延长内皮抑素的半衰期，为开发长效的内皮抑素制剂奠定基础。 1．EndoAlbu融合蛋白的空间结构预测为了延长Endostatin在体内作用的半衰期，采用富含甘氨酸与丝氨酸的柔性肽(Gly4Ser)<,3>将Endostatin与HSA进行连接，构成EndoAlbu融合蛋白。HSA由三个相似的结构域组成，每个结构域由两个亚结构域组成，形成圆桶状结构，几乎所有疏水性氨基酸都包埋在圆桶内部，构成疏水腔。为了验证HSA这种特殊的蛋白结构在融合蛋白中是否对Endostatin的功能位点产生影响，我们对融合蛋白的结构进行了预测。结果表明Endostatin的结构域保持独立。 2．EndoAlbu融合基因的构建采用重叠延伸PCR的方法，构建了融合基因EndoAlbu，并将其克隆入pGEM-T载体中。测序结果表明融合基因序列与GenBank数据库(NCBI)中的 Endostatin的AJ494837及HSA的CR607928序列完全一致。 3．EndoAlbu融合蛋白的表达、鉴定与纯化将EndoAlbu融合基因克隆至酵母表达载体pPIC9中，然后将鉴定正确的重组表达载体pPIC9-EndoAlbu线性化后转入GS115。采用原位双膜筛选法快速筛选出表达株，并对其进一步鉴定后进行扩大培养。采用硫酸铵沉淀和蓝色琼脂糖凝胶FF亲和层析的方法从酵母培养液的上清中成功分离出高纯度的目的蛋白。 4．EndoAlbu融合蛋白的生物学活性测定采用MTT法对纯化后的EndoAlbu融合蛋白进行测定，结果表明EndoAlbu融合蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV-304的增殖具有很好的抑制作用，抑制作用呈现剂量依赖性，其IC<,50>为8.4μg/mL。在CAM实验中发现其能显著抑制CAMx新生血管生长。 5．结论 本研究在对EndoAlbu融合蛋白空间结构预测的基础上，构建了EndoAlbu融合基因，并对融合蛋白进行了表达、鉴定、纯化及生物学活性的测定。结果表明表达的EndoAlbu融合蛋白具有良好的生物学活性，为长效Endostatin制剂的研究提供了理论依据。