来源于天然植物的提取物、活性单体成分及它们的衍生物在传统中医药预防和治疗领域中发挥着重要的作用。在过去十年里,随着化学合成药物的开发越来越困难,天然药物在世界范围内的许多国家和地区如日本、印度、美国、加拿大以及北美受到越来越多的亲睐。在美国,临床上大约20%的患者在接受常规治疗的同时还自行服用来源于天然植物的各种药品或保健品,而只有大约三分之一的患者会将自行服用药物的情况告知他们的医生。在这些人群中常常发生与药物有关的副作用。其中,大约40%的副作用都归因于植物药与化学药物间的相互作用。众多的消费者认为天然药物来源于天然植物,动物或矿物,因此它们相对化学合成药物更为安全。这种认识无疑夸大了天然药物的作用,忽略了它们潜在的副作用和毒性,给临床应用带来风险。事实证明,许多天然药物都具有副作用甚至毒性。由于天然药物发挥作用的物质基础复杂,其进入机体后的处置过程和对机体的影响都不明确,在与其它药物合用的时候常发生副作用或药物间的相互作用。随着药物不良反应监测的加强,天然药物不良反应的报道呈逐年增加的趋势。这种不良反应严重影响了天然药物的临床应用安全,同时也是天然药物走向国际市场的巨大障碍。我国传统中医理论指导下的中药是天然药物的主要来源。因此,从临床合理和安全用药的角度来讲,对中药特别是其活性成分在体内的代谢和基于代谢性相互作用的研究具有重要的意义。乌头类中药(乌头和附子)是中药基本药材,临床应用非常广泛,但它们也具有较强的毒性,临床上出现的有关乌头类中药的不良反应和中毒事件使它的应用受到了很大的限制。中医理论认为,乌头类中药与其他中药配伍使用后能达到“减毒增效”的效果,故临床上,乌头类中药一般与其它中药配伍使用,较少单独使用。尽管有关乌头类中药的研究众多,然而,迄今为止,其发挥药理作用的物质基础尚未完全明确,同时,乌头类中药与其它中药配伍使用的作用机制以及它对机体的影响也不清楚。同其它天然药物一样,乌头和附子中成分复杂,与其它中药配伍使用时的物质基础则更为复杂多变。近年来,随着越来越多的有关中药与中药,中药与化学药物之间的基于代谢性相互作用的报道出现,有关中药对药物代谢酶的影响的研究越来越受到重视。乌头碱(Aconitine, AC)是一种具有广泛药理活性的二萜双酯型生物碱,它是乌头和附子中的主要的有效/有毒成分,具有较强的抗炎、镇痛作用。。有关乌头碱代谢的研究表明,乌头碱在人和大鼠体内,其主要的代谢途径都是以水解代谢和脱甲基代谢、羟化代谢及脱氢代谢为主,这些代谢途径主要由CYP3A介导。然而,有关乌头碱对CYP450酶的影响的研究却未见报道。乌头类中药的毒性是否与其发挥药理作用的活性成分对体内代谢酶的影响有关?乌头类中药在临床与其它中药或化学药物合用时是否会发生药物相互作用?这些我们都还不清楚。因此,本论文选择了乌头碱这一具有代表性的乌头和附子中的主要的有效／有毒成分,从乌头碱对CYP450酶的体内外活性上入手,系统阐明乌头碱对参与药物代谢的关键CYP450亚酶的影响,为乌头类中药的临床合理应用和毒性预警提供理论依据。以下是本论文的主要研究内容。一、盐酸丁螺环酮在大鼠肝和肠微粒体中的代谢及其在大鼠体内的药代动力学方法：建立丁螺环酮及其主要代谢产物1-(2-嘧啶基)哌嗪(1-pyrimidinylpiperazin,1-PP)和6’-羟基丁螺环酮(6’-hydroxy buspirone,6’-OH-BP)的UPLC-MS/MS方法。考察盐酸丁螺环酮在大鼠肝和肠微粒体中的代谢及其在大鼠体内的药代动力学。结果：丁螺环酮在大鼠肝和肠微粒体中主要生成三个代谢产物：1-PP,6’-OH-BP和M3。当丁螺环酮的浓度为1.25～20μM时,其在肝微粒体中生成代谢产物的速率从大到小依次为6’-OH-BP>M3>1-PP,而在肠微粒体中生成代谢产物的速率从大到小依次为M3>6’-OH-BP>1-PP。大鼠口服不同剂量的盐酸丁螺环酮(12.5mg/kg,25mg/kg或50mg/kg),丁螺环酮及其代谢产物1-PP和6’-OH-BP在体内的暴露与给药剂量呈线性相关,即遵循一级动力学过程。丁螺环酮绝对生物利用度为4.3%～6.6%。口服给药时代谢产物1-PP和6’-OH-BP的血药浓度水平高于原型药物血药浓度水平。静脉注射盐酸丁螺环酮(0.5mg/kg)后,大鼠血浆中代谢产物1-PP和6’-OH-BP的血药浓度水平远低于原型药物血药浓度水平。二、乌头碱对CYP3A体内外活性的影响方法：采用丁螺环酮作为CYP3A的探针药物,用体外抑制实验的方法研究了乌头碱对雄性大鼠肝微粒体(male rat liver microsome, mRLM)、男性肝微粒体(male human liver microsome, mHLM)以及人重组CYP3A4(recombination CYP3A4, rCYP3A4)的体外活性的影响。研究了大鼠单次或连续7天口服乌头碱后,静脉注射盐酸丁螺环酮,乌头碱对丁螺环酮及其代谢产物1-PP和6’-OH-BP的药代动力学的影响。大鼠连续7天口服乌头碱后,制备肝微粒体。采用丁螺环酮和睾酮作为CYP3A的探针药物,测定了肝微粒体中CYP3A的活性,并用Western blot测定肝微粒体中CYP3A的蛋白表达水平。采用非那西丁,地昔帕明和氯唑沙宗分别作为CYP1A2,CYP2D6和CYP2E1的探针药物,测定经7天乌头碱处理后的大鼠肝微粒体中CYP1A2, CYP2D6和CYP2E1的活性。结果：丁螺环酮N-脱烷基化反应的速率过程表现出底物抑制(Substrate inhibition)的酶代动力学特征。乌头碱(0,10,20,40μM)与丁螺环酮在含rCYP3A4的Ⅰ相代谢体系中共同孵育时,丁螺环酮N-脱烷基化的最大反应速率Vmax分别为：207.70nmol/min-mg,1497.00nmol/min-mg,655.80nmol/min-mg和48.71nmol/min-mg; Km分别为：1.74μM,25.18μM,14.96μM和0.79μM。随着乌头碱的加入,清除率Vmax/Km降低,分别为：119.37ml/min/mg,59.45ml/min/mg,43.84ml/min/mg和61.50ml/min/mg。乌头碱对rCYP3A4的体外活性具有抑制作用,但这种抑制没有明显的浓度依赖。乌头碱(0,10,20,40μM)与丁螺环酮在含有mHLM的Ⅰ相代谢体系中共同孵育时丁螺环酮N-脱烷基化的最大反应速率Vmax分别为：136.30nmol/min-mg,316.80nmol/min-mg,253.30mol/min-mg和473.80nmol/min-mg;Km分别为：26.41μM,4.34μM,7.88μM和17.22μM。随着乌头碱的加入,清除率Vmax/Km增加,分别为：5.16ml/min/mg,72.96ml/min/mg,32.14ml/min/mg和27.51ml/min/mg。乌头碱对mHLM的体外活性具有激活作用,但这种激活没有明显的浓度依赖。乌头碱(0,10,20,40μM)与丁螺环酮在含有mRLM的Ⅰ相代谢体系中共同孵育时,丁螺环酮N-脱烷基化的最大反应速率Vmax分别为：425.6nmol/min-mg,343.3nmol/min-mg,179.5nmol/min-mg和276.9nmol/min-mg; Km分别为：1.41μM,2.88μM,0.32μM和2.58μM。清除率Vmax/Km分别为：300.99ml/min/mg,119.28ml/min/mg,566.42ml/min/mg和107.20ml/min/mg.乌头碱对mRLM的体外代谢活性没有影响。乌头碱(0,10,20,40μM)与丁螺环酮在含有rCYP3A4(mHLM或mRLM)的Ⅰ相代谢体系中共同孵育时,丁螺环酮6’-羟基化反应的速率分别表现出经典的米式方程(Michaelis-Menten),自体活化(Autoactivation)或双向调节(Biphasic)的酶代动学特征。乌头碱(0,10,20,40μM)与丁螺环酮在含有rCYP3A4的Ⅰ相代谢体系中共同孵育时丁螺环酮6’-羟基化的速率最大反应速率Vmax降低,分别为：1599.90nmol/min-mg,952.30nmol/min-mg,964.60nmol/min·mg和723.20nmol/min·mg; Km分别为：26.53μM,9.51μM,23.12μM和723.20μM。随着乌头碱的加入,清除率Vmax/Km降低,分别为：60.31ml/min/mg,100.14ml/min/mg,41.72ml/min/mg和34.05ml/min/mg。乌头碱对rCYP3A4的体外活性有抑制作用,但这种抑制没有明显的浓度依赖。乌头碱对丁螺环酮在mHLM和mRLM中的6’-羟基化反应速率没有影响。大鼠单次口服乌头碱(0.125mg/kg)后,静脉注射盐酸丁螺环酮(0.5mg/kg),丁螺环酮及其代谢产物的药代动力学参数变化如下：与对照组相比较,丁螺环酮,1-PP和6’-OH-BP的AUCo0-t.分别上升了32%(P<0.05),23%和66%(P<0.05)；(Cmax分别上升了57%(P<0.05),37%(P<0.05)和16%；t1/2分别缩短至对照组的66%,46%(P<0.05)和72%；CL减小至对照组的79%(P<0.05),90%和55%；Vd减小至对照组的45%,57%(P<0.05)和40%；1-PP和6’-OH-BP与原型药物的代谢比分别为对照组的94%和129%。以上结果表明,单次口服乌头碱对静脉注射盐酸丁螺环酮的药代动力学有影响：丁螺环酮及其代谢产物的血浆暴露水平同时上升,但1-PP和6’-OH-BP与原型药物的代谢比没有改变,因此我们推测单次口服乌头碱,乌头碱可能没有影响大鼠体内CYP3A的活性。大鼠连续7天口服乌头碱(0.125mg/kg)后,静脉注射盐酸丁螺环酮(0.5mg/kg),丁螺环酮及其代谢产物的的药代动力学参数变化如下：与对照组相比较,丁螺环酮,1-PP和6’-OH-BP的AUCo-t分别为对照组的73%,90%和95%；Cmax分别为对照组的91%,103%和117%；t1/2,CL,确以及1-PP和6’-OH-BP与原型药物的代谢比与对照组相比较均无统计学意义。以上结果表明,连续7天口服乌头碱,乌头碱对大鼠体内CYP3A的活性没有影响。采用丁螺环酮和睾酮作为CYP3A的探针药物,对经连续7天乌头碱口服给药后的大鼠肝微粒体的活性测定表明：与对照组相比较,经乌头碱处理过的大鼠肝微粒体中CYP3A的活性略有上调(P<0.05),但这种上调未超过对照组活性的20%,其与阳性对照相比也未达到阳性对照组活性的40%。因此,我们认为：连续7天口服乌头碱,乌头碱对大鼠体内CYP3A的活性没有影响。CYP3A活性的微弱上调可能与酶的的激动有关,也可能是实验本身的误差造成。采用Western blot对经连续7天乌头碱口服给药后的大鼠肝微粒体中CYP3A的蛋白表达水平测定的结果表明：连续7天口服乌头碱对大鼠体内CYP3A蛋白表达没有影响。采用非那西丁,地昔帕明和氯唑沙宗分别作为CYP1A2,CYP2D6和CYP2E1的探针药物,对连续7天乌头碱口服给药后的大鼠肝微粒体中CYP1A2,CYP2D6和CYP2E1的活性测定结果表明：连续7天口服乌头碱对大鼠体内CYP1A2, CYP2D6和CYP2E1的活性没有影响。三、乌头碱对口服盐酸丁螺环酮大鼠体内药代动力学的影响方法：研究了单次或连续7天口服乌头碱后,大鼠口服盐酸丁螺环酮,乌头碱对丁螺环酮及其代谢产物1-PP和6’-OH-BP的药代动力学的影响。结果：大鼠单次口服乌头碱(0.125mg/kg或0.25mg/kg)后,口服盐酸丁螺环酮(25mg/kg),丁螺环酮及其代谢产物的的药代动力参数变化如下：丁螺环酮的Cmax和AUC0-t在不同乌头碱剂量组呈不同的变化趋势。与对照组相比较,乌头碱0.125mg/kg组的丁螺环酮的AUC0-t下降至对照组的47%(P<0.05), Cmax下降至对照组的16%(P<0.05),t1/2缩短至对照组的26%(P<0.05),Vd为对照组的67%；1-PP的AUC0-t下降至对照组的68%,Cmax下降至对照组的61%(P<0.05),t1/2和Vd升高至对照组的144%(P<0.05)和170%(P<0.05)；6’-OH-BP的Cmax下降至对照组的60%,但其AUCmax为对照的93%,基本不变,t1/2和Vd分别为对照组的73%和82%。1-PP与丁螺环酮的代谢比为对照组的149%,6’-OH-BP与丁螺环酮的代谢比为对照组的174%(P<0.05)。与对照组相比较,乌头碱0.25mg/kg组的丁螺环酮的AUC0-t和Cmax呈微弱的上升趋势,但与对照组相比较没有统计学意义。1-PP的AUC0-1和Cmax分别为对照组的132%(P<0.05)和147%,6’-OH-BP的AUC0-t和Cmax分别为对照组的153%(P<0.05)和184%,Vd为对照组的60%(P<0.05)。1-PP和6’-OH-BP与丁螺环酮的代谢比分别为对照组的124%和130%。以上结果表明：大鼠单次口服乌头碱处理,对口服盐酸丁螺环酮及其代谢产物的药代动力学产生了影响,且不同剂量的乌头碱对盐酸丁螺环酮的药代动力学有不同的影响。我们推测乌头碱可能影响原型药物丁螺环酮的吸收,通过影响丁螺环酮的吸收,进一步影响了其代谢产物1-PP和6’-OH-BP的药代动力学过程。由于乌头碱对1-PP和6’-OH-BP与丁螺环酮的代谢比影响不显著,因此我们认为,乌头碱对大鼠体内CYP3A的活性没有影响。大鼠连续口服乌头碱(0.125mg/kg)7天后,再口服盐酸丁螺环酮(25mg/kg),乌头碱对盐酸丁螺环酮的药动学产生了较大的影响。与对照组相比较,乌头碱组丁螺环酮的AUC0-t增加了1倍(P<0.05),1-PP的AUC0-t增加了5倍(P<0.05),Cmax增加了2.3倍(P<0.05),t1/2缩短至对照组的61%(P<0.05),Vd降低至对照组的9%(P<0.05),1-PP与原型药物的代谢比增加了2.3倍(P<0.05)。6’-OH-BP的血药浓度下降明显：这种变化趋势与1-PP的相反,与对照组相比较,乌头碱组的6’-OH-BP的AUC0-t和Cmax分别下降至对照组的12%(P<0.05)和9%(P<0.05),Vd则比对照组升高了7.3倍(P<0.05),6’-OH-BP与原型药物的代谢比降低至对照组的5%(P<0.05)。以上结果表明：大鼠经连续7天口服乌头碱后再口服盐酸丁螺环酮,乌头碱可能通过影响丁螺环酮及其代谢产物在体内的分布和排泄,进而影响了丁螺环酮及其代谢产物在血浆中的暴露水平。结论：本文采用探针法系统研究了乌头碱对参与药物代谢的主要CYP450酶的影响。结果表明：当乌头碱的浓度为10～40μM时,对rCYP3A4的体外活性有抑制作用,对mHLM的体外活性具有激活作用;单次口服乌头碱(0.125mg/kg)对静脉注射盐酸丁螺环酮(0.5mg/kg)的药代动力学有较小的影响(P<0.05),连续7天口服乌头碱(0.125mg/kg)对静脉注射盐酸丁螺环酮(0.5mg/kg)的药代动力学没有影响；连续7天口服乌头碱(0.125mg/kg或0.25mg/kg)对大鼠CYP3A的活性和蛋白表达都没有影响,且对大鼠CYP1A2, CYP2D6和CYP2E1的活性没有影响；单次或7天口服乌头碱显著影响口服盐酸丁螺环酮的药代动力学(P<0.05),我们推测乌头碱可能通过影响丁螺环酮的吸收、分布和排泄,进而影响了丁螺环酮及其代谢产物在血浆中的暴露水平。临床上乌头碱暴露增加基于代谢性的药物相互作用的风险较小。