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为提高鸡球虫病活疫苗免疫效果,我们研发了鸡白介素4（chIL-4）和鸡白介素2（chIL-2）的融合基因真核表达载体pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP。该载体表达分泌的chIL-4-chIL-2融合蛋白可增强鸡球虫病活疫苗免疫效果,降低活疫苗副作用。为确立pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP的大规模生产、提取纯化工艺以及建立产品的质量控制体系,本研究对pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组大肠杆菌的培养条件、保存稳定性和遗传稳定性进行研究,建立三级种子库,研究优化该重组质粒的提取纯化工艺,研究结果表明:（1）在37℃、42℃和生长对数期由37℃转42℃的条件下,pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组大肠杆菌在2×YT、LB、SOB、TB四种培养基中获得的最高质粒产量依次降低,且差异极显著（P<0.01）,但生产1g质粒的成本,LB、SOB、2×YT、TB培养基依次增高,表明LB培养基更适于大规模发酵生产质粒;四种培养基在37℃转42℃、37℃、42℃培养温度下获得的最高质粒产量均依次降低,且差异极显著（P<0.01）,表明在生长对数期对该重组大肠杆菌进行42℃诱导,可显著提高质粒产量。（2）通过连续传代法对pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组大肠杆菌进行30代传代,0代、5代、10代、15代、20代、25代、30代该重组大肠杆菌革兰氏阴性棒状短杆菌,均能发酵葡萄糖及甘露醇但不发酵乳糖,与大肠杆菌16S rRNA片段同源性均大于95%;各代质粒超螺旋比均大于90%,质粒丢失率均为0,且质粒双酶切产物凝胶电泳均出现约882bp和约4.7kb条带,表明30代内质粒未发生丢失且结构稳定;各代质粒细胞转染率、融合蛋白表达量差异不显著（P>0.05）,分泌蛋白均能有效促进鸡脾淋巴细胞增殖,且刺激指数差异不显著（P>0.05）,表明连续传代30代内该菌稳定,其重组质粒遗传稳定,该菌能稳定传代至少30代。同时,根据2015年版《中国兽药典》第三部建立了三级种子库,并对原始菌种、基础菌种和生产菌种进行了全面鉴定。（3）3个月内,冻干保存组各样品活菌数与保存前无显著差异（P>0.05）;4℃8%甘油保存菌保存2-3个月活菌数显著低于（P<0.05）保存前样品,下降率依次增高;保存3个月时,除4℃8%甘油保存菌活菌下降率（10.56%）显著（P<0.05）高于-80℃明胶蔗糖保存菌（-2.78%）外,其余条件保存菌活菌下降率间无显著差异（P>0.05）,质粒含量均无显著差异（P>0.05）,且质粒双酶切产物凝胶电泳均出现约882bp和约4.7kb条带,表明三个月内除4℃8%甘油外,蔗糖脱脂奶冻干、明胶蔗糖冻干及8%甘油保存条件均可稳定保存该重组大肠杆菌。（4）完全沉淀质粒DNA的最适十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）浓度为0.006%,用终浓度0.006%的CTAB和0.4 mol/L的MgCl2溶液提取的质粒DNA中检测不到菌体RNA及基因组DNA,质粒浓度为590μg/mL,纯度可达1.84,内毒素和杂蛋白含量分别为0.014 EU/μg质粒DNA和0.036μg/μg质粒DNA。