结直肠癌是一类严重威胁人类健康和生存的恶性肿瘤。据统计,在世界范围内,结直肠癌发病率及死亡率均居恶性肿瘤的第三位[1]。在我国,随着居民生活方式和膳食结构的改变,以及人口老龄化进程的加快,结直肠癌的发病率多年来呈明显上升趋势,多集中于60-74岁的老年人[2]。尽管近年来结直肠癌的早期诊断及治疗手段取得了一定的进步,但中晚期结直肠癌患者的死亡率仍居高不下,而转移和复发是导致死亡率明显增加的重要原因。据2016年最新癌症数据统计,发生远处转移的结直肠癌病人的五年生存率仅为13%[1]。因此,积极开展对结直肠癌转移机制的研究,寻找新的关键分子和治疗靶点,对结直肠癌的干预和治疗具有重大意义。上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)主要是指上皮细胞向间质细胞转化的过程。在这个过程中,上皮细胞逐渐失去上皮表型,如极性的丢失,细胞与细胞间连接消失,上皮标志物表达下调或缺失,继而逐渐获得间质细胞表型,如细胞骨架的重塑,间质标志物的表达增加或获得,细胞的迁移侵袭能力增强等[3,4]。目前普遍认为EMT在结直肠癌的转移中发挥着重要的作用。细胞内外的多种分子和信号通路参与其中,通过与细胞内外的不同分子相互作用,激活胞内不同的信号通路,各种信号通路相互交错形成复杂的网络,调控EMT的发生。其中,NF-κB信号通路,无论在与癌症发生发展密切相关的炎症发展过程,还是在癌症原发灶及转移灶的形成和发展中,都发挥着重要的作用[5,6]。其激活不仅是宿主抵抗感染及压力等所引起的炎症反应的中心环节。在癌症中,NF-κB也可通过上调多种调节细胞生存、增殖、迁移、侵袭的基因,同时对抗生长调节因子如抑癌基因p53等,发挥促进癌症发展的作用[5]。NF-κB下游一系列重要分子,尤其是锌指蛋白snail,参与NF-κB调节的多种癌症的发生发展过程。Snail可受NF-κB的诱导,为在EMT及癌症发生过程中,表达明显上调的多个转录因子之一。其激活后,可明显抑制在癌症EMT及转移过程中发挥核心作用的钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。有研究表明,snail不仅可调控上皮肿瘤细胞及间质宿主细胞的细胞结构,还可调节肿瘤细胞和宿主细胞之间的旁分泌过程及一系列信号通路,进而影响肿瘤转移的过程。因此,在肿瘤细胞中,snail的表达可以促进肿瘤EMT的发生,并为肿瘤干性及运动能力不可或缺的重要特征[7]。脂质运载蛋白2(Lipocalin2,LCN2),又称中性粒细胞白明胶酶-相关脂质运载蛋白(Netrophilgelatinase-associated Lipocalin2,NGAL),最初发现其可通过结合细菌生长所必需的铁离子从而抑制细菌的生长,参与固有免疫反应过程[8]。近年,大量研究表明LCN2在多种肿瘤中表达上调,参与肿瘤形成及转移的过程。但研究报道的其参与肿瘤进展的具体机制仍不清楚。如LCN2可以抑制肝细胞癌的EMT发生及转移,并且可以抑制胰腺癌的侵袭及血管生成;而在前列腺癌和肝癌中,LCN2则可通过调节不同通路从而促进EMT的发生。另外,LCN2还可在细胞内转运视黄醇,近年研究报道,其在细胞内发挥作用的主要形式,全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)参与多种肿瘤的发生发展过程,但其在不同肿瘤中的具体分子机制研究仍不明确。因此,本研究的主要目的是明确LCN2在结直肠癌中EMT发生过程中的作用,并探索具体的分子机制;同时探索ATRA是否在结直肠癌EMT发生过程中发挥作用,其对EMT的作用是否与LCN2有关。为了明确LCN2在结直肠癌EMT及转移中的作用,我们采取将LCN2敲除或过表达的实验方法,从体内及体外两个方面,对EMT相关标志物及生物学行为,进行了验证;并在临床样本中,对LCN2与EMT相关标志物的关系及其对预后的意义进行了分析。我们将构建好的含shRNA-LCN2慢病毒载体,感染LCN2高表达的细胞系SW480和HT29,将含LCN2-CDS区的慢病毒载体感染LCN2低表达的结直肠癌细胞系SW620和RKO,通过real-time qPCR及western blot的方法检测相关指标的mRNA及蛋白水平的变化;划痕实验检测结直肠癌细胞的运动能力改变;CCK8、克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化;transwell小室方法检测细胞迁移、侵袭等生物学行为的变化;同时,我们也建立了裸鼠原位移植瘤模型及肺部转移模型,在动物体内观察LCN2对肿瘤生长及转移的影响;最后分析临床样本中LCN2与相关指标的关系,及对结直肠癌病人预后的影响,明确LCN2在结直肠癌EMT中的作用及其临床意义。结果发现,LCN2敲除后可明显下调上皮标志物钙黏蛋白(E-cadherin)的表达,上调间质标志物波形蛋白(vimentin)的表达;增强细胞增殖、迁移、侵袭的能力;过表达LCN2后则抑制了EMT的发生及细胞增殖、迁移、侵袭能力。体内实验也证实,敲除LCN2后肿瘤生长速度、瘤体体积均明显高于转染空载体组,而过表达LCN2后肿瘤的生长则受到明显抑制;肺部转移实验也表明,过表达LCN2后裸鼠肺部转移灶的形成数量明显少于转染空载体组,提示LCN2可抑制结直肠癌中EMT的发生。为了进一步探索LCN2对EMT的抑制作用是否与NF-κB通路有关,我们在敲除或过表达LCN2的细胞系中,检测NF-κB及其磷酸化水平和snail表达变化的基础上,改变NF-κB及snail的活性或表达,观察相应生物学行为的改变及分子水平的表达情况,明确NF-κB/snail信号通路在LCN2调控的EMT过程中的作用。我们发现,敲除LCN2后,NF-κB的磷酸化水平、在细胞核内的聚集及其下游因子snail的表达明显升高,免疫荧光实验结果显示,LCN2敲除后,snail的荧光强度及其在细胞核内的分布明显增强;在过表达LCN2的细胞系中,NF-κB的表达、磷酸化水平及snail的表达则明显降低,snail在细胞核内的聚集及荧光强度明显减弱;荧光素酶报告基因的实验结果也表明,过表达LCN2可明显削弱NF-κB的启动子活性。随后我们选取结直肠癌细胞系SW480及SW620,分别外源加入20nM的NF-κB激活性leptomycinB(LMB)及50nM的NF-κB抑制剂Bay11-7082,检测NF-κB对结直肠癌EMT相关指标的影响。结果表明,NF-κB可明显下调E-cadherin的表达,上调vimentin及snail的表达,表明NF-κB在结直肠癌中促进EMT的发生。以上结果提示,NF-κB/snail信号通路可能在LCN2调节的EMT中发挥作用。为了进一步探讨NF-κB/snail信号通路在LCN2调节的EMT中可能发挥的作用,我们分别通过在敲除LCN2的SW480细胞系中外源加入0.05nM sip65减弱NF-κB表达,在过表达LCN2的SW620细胞系中外源加入NF-κB激活剂LMB增强其表达,及转染snail的过表达质粒恢复snail的表达,来明确LCN2是否可通过调节NF-κB/snail信号通路,发挥抑制结直肠癌EMT的作用。我们同样采用real-time qPCR及western blot方法,检测EMT相关指标的变化。结果显示,在LCN2敲除的细胞系SW480中,NF-κB的干扰可上调LCN2敲除引起的E-cadherin、ZO-1的下降,下调LCN2敲除诱发的vimentin及snail表达的上调;而在LCN2过表达的SW620细胞系中,恢复下降的NF-κB的表达后,则明显逆转过表达LCN2引起的E-cadherin、ZO-1表达的增加,vimentin及snail表达的减少;而在LCN2过表达的细胞系中恢复snail的表达后,同样可减弱LCN2对E-cadherin、ZO-1、vimentin和snail及迁移能力的影响。我们对结直肠癌病人临床组织样本,运用免疫组织化学方法,检测了LCN2、E-cadherin、β-catenin、增殖标志物Ki67,以及NF-κB的表达,并分析LCN2与E-cadherin、β-catenin以及Ki67三个EMT重要标志物的关系及LCN2及NF-κB的表达对结直肠癌预后的临床意义。结果证实,LCN2在结直肠癌原发灶中的表达明显高于淋巴结转移灶中的表达;且LCN2与E-cadherin呈明显正相关,与核内β-catenin的分布,及Ki67呈明显负相关;裸鼠体内成瘤的组织切片染色中也发现,LCN2与E-cadherin的变化水平相一致,与vimentin及Ki67的变化水平相反。而且根据LCN2及NF-κB的表达进行分组发现,LCN2表达阳性且NF-κB表达阴性的病人,其组织切片中snail在核内的分布明显较低,预后及五年生存率明显较好。最后,我们对ATRA在LCN2调控的结直肠癌EMT中的作用进行了探索。在内源性表达LCN2的SW480细胞系中,加入较高生理浓度的ATRA,检测其对EMT标志物、LCN2及迁移的影响。我们发现,ATRA可明显上调结直肠癌细胞中E-cadherin的表达及LCN2的水平,抑制vimentin的表达,NF-κB/snail信号通路的活性及细胞的迁移能力。LCN2特异性抗体可明显逆转ATRA引起的上皮表型变化及迁移能力的下调。综合上述研究结果,我们得出以下结论:1.在结直肠癌细胞系及裸鼠体内,LCN2可上调上皮标志物表达,下调间质标志物的表达,同时抑制细胞增殖,迁移和侵袭及肿瘤形成及转移能力;从而抑制结直肠癌中EMT及转移的发生。2.在结直肠癌细胞中,LCN2可通过抑制NF-κB/snail信号通路抑制结直肠癌中EMT的发生;LCN2表达阳性且NF-κB表达阴性的结直肠癌患者,其预后及五年生存率较好;因此LCN2/NF-κB/snail信号通路可能成为结直肠癌治疗的新靶点。3.在结直肠癌细胞中,ATRA可依赖LCN2,发挥抑制EMT的发生及NF-KB/snail信号通路的活性及结直肠癌细胞的迁移的作用。因此,ATRA可能可应用于临床结直肠癌的治疗。