肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，也是恶性肿瘤死亡的主要原因，并且近些年肺癌的死亡率及发病率在逐年上升，在全球范围内占各种恶性肿瘤的首位。根据肺癌的生物学特性和治疗方法不同，肿瘤临床学家把肺癌分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）及小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中以非小细胞肺癌为主，占所有类型的80％-85%，其中约30％左右的患者就诊时已是晚期，其中40％-50％已有远处转移，然而只有Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲa期（非N2患者）的非小细胞肺癌能够行根治性切除术，由于放射治疗亦为肿瘤的局部治疗手段，在面对分期较晚或已有远处转移的患者，化学治疗亦不可少，目前以铂类为基础并联合第三类抗肿瘤药物（如吉西他滨、培美曲塞、多西他赛等）的化疗方案被广泛采用，但化疗的有效率也仅为30%-40%，并且肿瘤耐药性问题日益凸显。总体来说非小细胞肺癌对放化疗不敏感，总缓解率低，晚期患者5年生存率仅为15%，严重威胁着患者的生命。随着肿瘤分子生物学的发展，在癌基因机制认识上的重大突破，促进了以阻断异常信号通路和代谢过程为特征的分子靶向药物应运而生。克唑替尼（Crizotinib）是口服型三磷酸腺苷竞争性抑制剂，可抑制ALK和MET酪氨酸激酶，还能够抑制ROS1和RON激酶的活性，是全球第一个批准上市的小分子ALK和c-MET双靶点口服抑制剂，也目前使用较为广泛的针对EML4-ALK融合基因的靶向治疗药物。　　JAK-STAT3信号转导通路的异常与肿瘤的细胞凋亡、血管新生、侵袭转移、增殖分化、免疫逃跑等密切相关。STAT3在细胞内将细胞外的信号传递至细胞核内，再通过诱导靶基因转录表达来起到生物效应。抑制STAT3的磷酸化就能够促进肿瘤细胞凋亡，抑制局部浸润、远处转移，提高自身免疫系统对肿瘤细胞的免疫应答。　　因此，本课题采用体外培养非小细胞肺癌H2228及H3122细胞株，观察克唑替尼对两种非小细胞肺癌细胞株的增殖抑制率，并结合放射治疗观察其对两种细胞株的增敏效应，探索其潜在机制的探索。　　实验方法：　　1 MTT法检测克唑替尼对非小细胞肺癌H2228及H3122细胞株增殖的抑制率；　　2平板克隆形成实验检测克唑替尼对非小细胞肺癌H2228及H3122细胞株放射敏感性的影响；　　3流式细胞技术检测克唑替尼对非小细胞肺癌H2228及H3122细胞株的细胞周期及凋亡率影响；　　4蛋白免疫印迹法检测非小细胞肺癌H2228及H3122细胞株经过克唑替尼联合放射线后STAT3及p-STAT3表达量的变化。　　实验结果：　　1 MTT实验结果显示：不同浓度的克唑替尼作用于 H2228细胞后，增殖抑制率分别是：2.89%，21.03%，34.09%，43.36%，60.75%，68.54%，84.02%在浓度25-1600nM的范围内，抑制率与浓度变化呈正相关。克唑替尼作用于H2228细胞24h后的IC50浓度为330nM。不同浓度的克唑替尼作用于H3122细胞后，增殖抑制率分别是：23.17%，37.98%，49.80%，58.46%，65.62%，76.46%，84.07%在浓度25-1600nM的范围内，抑制率与浓度变化呈正相关。克唑替尼作用于H3122细胞24h后的IC50浓度为102nM。　　2克隆形成实验结果显示：在等量照射剂量下，附加药物照射的细胞存活分数明显低于单纯照射组（P<0.05）。同组中，照射剂量越大，其细胞存活分数越低（P<0.05）。当大剂量照射时（6、8Gy），H2228细胞株在克唑替尼及放射线的作用下较H3122细胞相比，存活分数更低（P<0.05）。在H2228细胞株组中，联用克唑替尼照射组的D0值（平均致死剂量）、Dq值（细胞损伤的准域剂量）、N值（放射损伤修复能力）、SF2（照射2Gy后的细胞存活分数）分别为：2.228、1.673、2.329、0.730小于单纯照射组的2.435、1.806、2.500、0.893，SER（D0）：1.064；SER（Dq）：1.079。在H3122细胞株组中，联用克唑替尼照射组为：3.321、2.342、3.135、0.754也小于单纯照射组的3.333、2.452、3.485、0.930，SER（D0）：1.004；SER（Dq）：1.047。说明克唑替尼能有效减弱H2228及H3122细胞株的放射抗拒性及亚致死性损伤修复的能力，增强其放射敏感性，而且对于 H2228细胞株的放射增敏效果更加明显。　　3流式细胞术实验结果显示：H2228及H3122细胞的凋亡率与照射剂量呈正比。在单纯照射组（R1组、R2组），随着照射剂量的增加，细胞凋亡率上升。在照射剂量相同的情况下，附加克唑替尼的细胞株经照射后细胞凋亡率明显高于单纯照射组，在4Gy、6Gy、8Gy照射下，附加药物照射组的细胞凋亡率与单纯照射组相比有明显差异（P<0.05）。在6Gy、8Gy照射下，H2228细胞株在克唑替尼及放射线的作用下较H3122细胞相比，凋亡率更高（P<0.05）。在H2228组细胞中，R1组细胞随着照射剂量增加，G0/G1期细胞比率轻微升高；S期细胞比率逐渐减少；G2/M期细胞比率逐渐升高。与 R1组相比，应用了克唑替尼的RA组细胞随着照射剂量增加，G0/G1期细胞阻滞现象明显；S期细胞比率轻微减少；G2/M期细胞比率轻微增高。RA组与R1组相比，G0/G1期细胞阻滞现象尤为突出。在H3122组细胞中，随着照射剂量增加，R2组与RB组细胞各周期比率均表现出相同的变化趋势，G0/G1期未见明显变化，S期轻微减少，G2/M期明显增加。RB组与R2组相比，各周期细胞比率均不具有差异性。　　4 Western Blot法检测结果显示：在H2228细胞组中，在相同剂量照射下，应用克唑替尼联合时 STAT3的表达量较单纯照射升高，具有统计学意义（P<0.05）；p-STAT3的表达量较单纯照射降低，具有统计学意义（P<0.05）。在H3122细胞组中，在相同剂量照射下，应用克唑替尼联合时STAT3的表达量较单纯照射升高，具有统计学意义（P<0.05）；p-STAT3的表达量较单纯照射降低，具有统计学意义（P<0.05）。H2228细胞株与H3122细胞株相比，STAT3的表达量升高的更为明显（P<0.05）；p-STAT3的表达量降低的更为明显（P<0.05）。　　结论：　　1在本实验设计的药物浓度范围内，克唑替尼能有效抑制人非小细胞肺癌H2228及H3122细胞株的增殖。　　2非小细胞肺癌H2228及H3122细胞株克隆形成率与照射剂量呈反比，在等量照射剂量下，附加药物照射的细胞株克隆形成率明显低于单纯照射组。克唑替尼对于H2228及H3122细胞株均具有放射增敏作用，而对于H2228细胞株的放射增敏效果更加明显。　　3克唑替尼能够明显的增加H2228细胞株对放射线相对敏感的G0/G1期细胞比率，轻微增加对放射线最为敏感的G2/M期细胞比率，降低对射线不敏感的S期细胞比率；H3122细胞株在克唑替尼作用前后，各周期细胞比率无明显变化。　　4应用克唑替尼经放射线照射后H2228及H3122细胞株的STAT3蛋白表达量较等剂量单纯照射时升高，p-STAT3蛋白表达量较等剂量单纯照射时降低， H2228细胞株在放射线及克唑替尼的作用下，对 STAT3磷酸化的阻滞作用较H3122细胞株更为明显。克唑替尼的放射增敏效应可能与其抑制STAT3蛋白磷酸化，进一步阻滞JAK-STAT3信号转导通路有关。