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目的用结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6-MPT64疫苗免疫BALB/c小鼠,比较各种途径接种疫苗,结核减毒株攻击后产生的免疫保护力及鼠脾细胞培养上清液IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10的变化;动态观察rBb-ESAT-6-MPT64疫苗皮下注射接种和鼻腔粘膜接种BALB/c小鼠后,血清IgE、IgG及其亚类变化﹑脾T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群变化、脾细胞培养上清液IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10的变化﹑脾T淋巴细胞增殖产生的免疫应答。从而为TB的防治提供一种有价值的疫苗。方法为了研究rBb-ESAT-6-MPT64疫苗免疫BALB/c小鼠后,抗MTB攻击产生的免疫保护力,将65只雌性BALB/c小鼠随机分为5组,每组13只。A组: 5×106CFU rBb-ESAT-6-MPT64疫苗悬浮于100μl PBS于小鼠后背部皮下单次注射;B组:5×106CFU rBb-ESAT-6-MPT64疫苗悬浮于100μl PBS于小鼠后腿股四头肌肌肉注射;C组:5×105CFUrBb-ESAT-6-MPT64疫苗悬浮于10μl PBS于小鼠鼻腔粘膜单次接种;D组:5×106CFU Bb悬浮于100μl PBS于小鼠后背部皮下单次注射;E组:PBS皮下注射对照。5组小鼠免疫8w后用MTB H37Ra减毒株鼻腔粘膜攻击感染。在MTB攻击感染后6w,杀鼠取肝、肺作细菌负荷量测定;ELISA方法检测各组鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE抗体水平和各组鼠脾细胞体外培养原液及在受到MTBAg和ConA或LPS刺激后分别产生的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10的水平。为了研究rBb-ESAT-6-MPT64疫苗皮下注射和鼻腔粘膜接种免疫BALB/c小鼠诱导的免疫应答类型及动态变化,将60只雌性BALB/c小鼠随机分为2组,每组30只。Ⅰ组:5×106CFU rBb-ESAT-6-MPT64疫苗悬浮于100μl PBS于小鼠后背部皮下单次注射;Ⅱ组:5×105CFU rBb-ESAT-6-MPT64疫苗悬浮于10μl PBS于小鼠鼻腔粘膜单次接种。于免疫前和免疫后2、4、6、8和10w分别剖杀4只小鼠,收集血清,ELISA方法检测各组鼠在免疫后不同时间血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE抗体水平以及脾细胞体外培养原液及在受到MTBAg和ConA或LPS刺激后分别产生的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10的变化;用FCM检测各组鼠在免疫前和免疫后不同时间(免疫后2、4、6、8和10w)脾细胞CD4+和CD8+亚群的变化;用MTT比色法检测脾细胞增殖水平。结果rBb-ESAT-6-MPT64疫苗免疫BALB/c小鼠8w后用5×105CFU MTBH37Ra减毒株进行鼻腔粘膜内攻击感染,在H37Ra攻击感染后6w杀鼠取肝、肺作细菌负荷量测定。其结果:鼻腔粘膜接种组(IN)和皮下注射组(SC)明显低于PBS对照组(P<0.01),鼻腔粘膜接种组(IN)也明显低于皮下注射组(SC),皮下注射组(SC)的肝、肺组织荷菌量低于肌肉注射组(IM)。ELISA法检测抗体结果:A～C组中,小鼠IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b水平均较对照组D、E组显著增高,IgG3和IgE水平均较对照组D、E组无显著差异;3组之间的相互比较:C组IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b水平较A、B组显著增高,C组IgG3和IgE水平均较A、B组无显著差异,A、B组之间各抗体水平无显著差异。ELISA法检测细胞因子变化结果:A～C组中,小鼠脾细胞原液组、MTBAg刺激组和ConA刺激组或LPS刺激组IFN-γ、IL-12和TNF-α水平均显著高于PBS对照组,A～C组中,小鼠脾细胞原液组、MTBAg刺激组和ConA刺激组IL-10水平均显著低于PBS对照组。rBb-ESAT-6-MPT64疫苗免疫BALB/c小鼠后ELISA法检测抗体结果:皮下接种组IgG从免疫后2w开始升高,免疫后8w达最高水平,IgG1变化甚微,仅在免疫后8w时有所降低,IgG2a从免疫后2w开始升高,免疫后6w达最高水平,IgG2b从免疫后2w开始升高并且达到最高水平,IgG3免疫后2w开始降低,免疫后8w和10w最低,IgE免疫后2w开始降低,免疫后8w和10w最低;鼻腔粘膜接种组IgG从免疫后2w开始升高,免疫后8w达最高水平,IgG1变化甚微,仅在免疫后8w、10w时有所降低,IgG2a从免疫后2w开始升高,免疫后6w达最高水平,IgG2b从免疫后2w开始升高并且达到最高水平,IgG3免疫后2w开始降低,免疫后8w和10w最低,IgE免疫后2w开始降低,免疫后8w和10w最低。用ELISA法检测细胞因子变化结果:IFN-γ水平皮下注射组从免疫后2w开始升高,在免疫后6w达到高峰,鼻腔粘膜接种组从免疫后2w开始升高,在免疫后6w和8w达到高峰;IL-12水平皮下注射组从免疫后2w开始升高,在免疫后4w达到高峰,鼻腔粘膜接种组从免疫后2w开始升高,在免疫后4w、6w和8w达到高峰;TNF-α水平皮下注射组从免疫后2w开始升高,在免疫后6w达到高峰,鼻腔粘膜接种组从免疫后2w开始升高,在免疫后6w和8w达到高峰;IL-10水平皮下注射组从免疫后2w开始升高,在免疫后6w和8w达到高峰,鼻腔粘膜接种组从免疫后2w开始升高,在免疫后8w达到高峰。用FCM检测CD4+和CD8+亚群水平结果:皮下注射组和鼻腔粘膜接种组分别在免疫后2w和4、6w CD4+亚群水平分别较0w有统计学意义增加;皮下注射组和鼻腔粘膜接种组免疫后4w时CD8+亚群水平较0w增加,但无显著差异;两组之间在同一时间点两两比较,CD4+亚群水平中,皮下注射组较鼻腔粘膜接种组有所增加;CD8+亚群水平中,两组间同一时间无统计学意义。用MTT法检测的小鼠脾淋巴细胞增殖结果:皮下注射组从免疫后2w开始升高,MTB Ag刺激组和ConA刺激培养组淋巴细胞增殖在2w达到高峰;鼻腔粘膜接种组从免疫后2w开始升高,MTB Ag刺激组淋巴细胞增殖在2w达到高峰,ConA刺激培养组淋巴细胞增殖在4w达到高峰。结论rBb-ESAT-6-MPT64疫苗免疫,H37Ra攻击感染后,小鼠肝、肺细菌负荷量明显降低;小鼠IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b水平明显升高,IgG3和IgE水平变化不大,其中以鼻腔粘膜接种组的保护力最好。rBb-ESAT-6-MPT64疫苗免疫加攻击组产生高水平的IFN-γ、IL-12和TNF-α,以及低水平的IL-10,提示产生较强的Th1细胞免疫应答。rBb-ESAT-6-MPT64疫苗免疫BALB/c小鼠后产生高水平的IgG、IgG2a和IgG2b抗体,低水平的IgG1、IgG3和IgE,提示IgG、IgG2a和IgG2b可能参与体液免疫应答机制。rBb-ESAT-6-MPT64疫苗能诱导BALB/c小鼠产生较强的特异性CD4+Th1型细胞免疫、体液免疫及微弱的CD8+CTL反应。rBb-ESAT-6-MPT64疫苗鼻腔粘膜效果优于皮下注射和肌肉注射。