猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是一种组织嗜性很强的革兰氏阴性菌，感染仔猪以纤维素性胸膜肺炎和出血性坏死性肺炎为特征，具有高度传染性和致死性的呼吸系统疾病，黏附是APP定植和致病的关键因素。三聚体自转运黏附素(Trimeric Autotransporter Adhesin，TAA)是近年来新发现的一种能够造成细菌感染致病的重要毒力因子。肺泡巨噬细胞（Primaryalveolar macrophages，PAMs）是肺部最早接触病原微生物的免疫防御细胞之一，参与宿主天然性免疫和特异性免疫，细菌与PAMs的互作研究成为细菌致病机制的新热点。本实验室前期研究证实APP5b血清型L20强菌株上存在TAA，命名为Apa1，并证实其关键功能结构域为Adh。本研究针对Adh开展以下工作：1、利用Adh基因缺失菌株研究了Adh介导APP对仔猪PAMs的致病机制。本研究体外分离猪原代肺巨噬细胞并以5b野生菌（5b WT）和Adh基因缺失菌（5bΔAdh）加以感染，比较两种细菌感染后细胞的差异，对感染早期10种炎症相关的细胞因子进行细胞因子芯片和ELISA分析，发现5b WT感染过程中唯有趋化因子IL-8的分泌显著高于5b ΔAdh（p<0.05）。通过相应信号通路抑制剂添加发现p38磷酸化被抑制后IL-8mRNA表达及因子分泌水平极显著降低（p<0.01），但对5bΔAdh感染的PAM细胞无影响，WesternBlot等方法证实Adh通过p38的磷酸化介导IL-8的高表达。体外中性粒细胞趋化实验表明Adh的缺失对中性粒细胞体外趋化降低20%。另外发现三聚体自转运粘附素Adh可以介导APP引起的PAMs凋亡，Adh通过活化Fas和Bax等，激活下游caspase-8、9、3，从而促进PAMs的凋亡。2、利用APP特异性全基因组表达谱芯片技术系统分析了野生菌及Adh缺失菌在与宿主PAMs互作中的相应性表达谱变化。本研究以目前报道的APP全基因组2886个基因为研究对象，结果发现在5b WT感染PAMs过程中有185个基因发生显著性差异变化，包括92个上调基因和93个下调基因，上调基因主要参与能量代谢、基因转录与翻译、毒力相关基因及三聚体自转运粘附素等；下调基因主要参与氨基酸代谢、ABC转运和辅酶代谢等。同时本研究首次报道了大量APP参与感染PAMs的新型毒力因子。通过将5b WT和5b ΔAdh表达谱进行比较分析，获得了受三聚体自转运粘附素功能区Adh调控的相关基因，共87个显著性差异基因，其中包括46个上调基因和41个下调基因，上调基因主要集中到假定蛋白、脂代谢、能量代谢，基因的转录和加工等功能，下调基因则集中在假定蛋白、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、二级代谢合成等。3、Adh在PAMs的互作蛋白的筛选与鉴定。目前，三聚体自转运粘附素与PAMs表面的互作蛋白尚未见报道，为此本研究以原核表达的Adh蛋白为诱饵，与RIPA裂解后的原代肺猪肺巨噬细胞总蛋白进行免疫共沉淀，洗脱获取的疑似蛋白经蛋白质质谱及Uniprot蛋白数据库预测分析，共获取24种疑似互作蛋白。其中含量最高的蛋白为角蛋白，其次是血清白蛋白和热休克蛋白70（HSP70）。具有膜表面分布的蛋白主要有嗅觉感受器受体、纤维母细胞生长因子受体等及胞内NOD样受体。将Uniprot预测的疑似蛋白基因插入到pDisplay载体中，构建真核细胞膜表面表达载体，转染293T细胞，通过Adh粘附分析发现OR5M11基因表达产物粘附活性最高，且能促进APP粘附293T细胞；利用OR5M11特异性抗体预处理细胞能够显著降低APP粘附PAMs及减少PAMs IL-8的释放，并能显著降低APP对PAMs的诱导凋亡作用。流式细胞检测发现除PAM细胞，人肺上皮细胞A549细胞系也存在OR5M11蛋白，提示Adh也具有介导APP对A549细胞的粘附作用。4、以小鼠为动物模型，研究了Adh的致病作用与机制。本研究以APP5bWT和5b ΔAdh共同滴鼻感染BALB/c小鼠，建立APP呼吸道感染小鼠模型，研究两菌对小鼠的致病力差异。结果表明以2×108CFU，1×108CFU的APP感染小鼠，5b ΔAdh对小鼠致死率显著降低于野生菌，表现为肺脏病理变化较轻、肺增重比下//肺灌洗液中总蛋白含量显著降低（p＜0.05）、肺脏中前炎性细胞因子IL-1β和趋化因子CXCL1表达显著下调。与5bΔAdh感染小鼠相比，5b WT感染后大量炎性细胞聚集于肺泡、肺间质以及支气管周围。为证实Adh通过诱导中性粒细胞过量募集导致的肺损伤，利用G31P（趋化因子受体阻断剂）处理小鼠可以显著减弱5b WT感染所引起的肺脏中性粒细胞过量募集，且显著缓解5b WT感染造成的肺部炎症。肺脏免疫组化结果证实Adh参与APP感染小鼠MAPK信号转导通路的激活及促进caspase-3表达，与细胞水平相一致。本研究首次证实三聚体自转运黏附素在APP感染小鼠过程中起重要作用，主要通过参与p38的磷酸化、早期炎性因子及中性粒细胞趋化因子的释放等，诱发高水平免疫应答增强APP对小鼠的致病性。5、将致病菌APP回归易感动物仔猪，研究Adh参与的APP对仔猪致病性。本研究以5b WT和5bΔAdh菌株共同感染45日龄仔猪，观察感染后仔猪临床症状及病理变化，结果表明Adh参与APP对仔猪的早期致病性，主要变现为：5bΔAdh感染较5b WT肺炎临床症状显著滞后、肺脏细菌定植量减少、炎性因子特别是IL-8显著降低等。仔猪血液常规的检测结果发现5b WT在感染后24h外周血出现典型的中性粒细胞高峰，而5bΔAdh感染仔猪未出现该现象。通过免疫组化进一步证实Adh参与肺脏细胞分泌IL-8、MAPK信号转导通路的活化以及细胞凋亡的发生。同时，为弄清5b WT和5bΔAdh感染仔猪肺脏内在差异，采用猪特异性肺脏表达谱芯片技术对感染仔猪肺脏进行差异基因检测，与5b WT相比5bΔAdh感染仔猪肺脏共发现495个显著性差异基因，包括274个上调基因，221个下调基因，上调基因主要集中在抗原加工与递呈、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、DNA复制等，而下调通路主要集中在肌动蛋白的内化调节、细胞间粘附以及内吞小体的形成途径。芯片结果分析表明Adh可能通过下调宿主抗原加工与递呈基因的表达增强对仔猪的致病性。该研究从易感动物机体上证实三聚体自转运粘附素Adh参与的APP对仔猪致病性，为APP引起仔猪专嗜性肺炎的发生机制奠定基础。