细胞凋亡相关的生物传感研究

来源 :湖南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qdjmyuzhou
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与细胞繁殖、分化一样,细胞凋亡也是各种生命活动中不可或缺的过程。异常的细胞凋亡会导致各种疾病,为了对这些疾病进行诊断或者治疗,需要检测相关细胞的凋亡情况。Caspases-3是细胞凋亡过程中极其重要的蛋白酶之一,可以通过检测它的活性来判断细胞凋亡情况。另外,石英晶体微天平(QCM)可以反映物质粘附在电极表面上的质量和粘弹力,因此可用来实时监测细胞的粘附、繁殖和凋亡过程。为了促进细胞在传感器表面的生长,构建细胞相容性界面是研制细胞传感器的首要和必要步骤。基于此,本论文在细胞相容性界面的构筑、细胞凋亡过程的QCM实时监测及caspase-3活性检测方面开展了一系列研究,主要研究工作如下:  1.首次研究了哺乳动物细胞在电聚合邻苯二胺(PPD)绝缘膜上的粘附、铺展和繁殖,并用该膜作为细胞生长基底构建了QCM细胞传感器,实现了细胞凋亡过程的实时监测。用循环伏安法在氧化铟锡(ITO)导电玻璃上电聚合形成PPD膜,研究了不同细胞(人体乳腺癌细胞MCF-7、人成骨肉瘤细胞MG-63和小鼠成纤维细胞NIH-3T3)在PPD膜上的生长情况。研究结果表明:与ITO和组织培养用聚苯乙烯(TCPS)基底相比,细胞在PPD膜上的粘附和铺展速率更快,活性更高,说明PPD具有优良的细胞相容性。基于此,将PPD膜用于石英晶体金电极的表面修饰,支持MCF-7细胞生长,构建了QCM细胞传感器。以喜树碱为凋亡诱导剂,用QCM技术实时监测了MCF-7细胞的凋亡过程。QCM响应与荧光显微镜观察结果相一致。且PPD膜易于从金表面完全去除,提高了石英晶体谐振器的重复利用性。  2.将氧化石墨烯修饰在壳聚糖膜表面,显著改善了壳聚糖膜的细胞相容性。用扫描电子显微镜和接触角测试对界面进行了表征,结果表明氧化石墨烯在壳聚糖膜上的吸附增加了壳聚糖表面的粗糙度和亲水性。通过细胞形态观察和MTT比色法研究了小鼠成纤维细胞NIH-3T3在氧化石墨烯/壳聚糖(GO/CS)上的粘附、铺展、繁殖情况,发现NIH-3T3细胞在壳聚糖表面很难粘附,却在2 h内全部粘附在石墨烯修饰后的壳聚糖膜上,并且形成漂亮的纺锤形。考察了石墨烯浓度和修饰时间对细胞粘附和铺展的影响,结果表明石墨烯浓度只要大于或等于50μg·mL-1,在壳聚糖表面自组装10 min就能够很好地促进细胞的粘附和繁殖。  3.基于酪氨酸的电化学活性,设计了一条含有酪氨酸残基和DEVD序列(caspase-3识别位点)的多肽CY9,实现了凋亡蛋白酶caspase-3的无标记电化学检测。用微分脉冲伏安法(DPV)检测了自组装在金电极上的多肽中酪氨酸残基的电化学信号,研究了检测溶液pH值和多肽自组装时间对DPV信号的影响。结果表明:酪氨酸残基的氧化峰随着pH值的增大发生负移,峰电流增大;时间为10 h时,多肽自组装达到饱和状态。在最优实验的条件下,研究了caspase-3酶促反应动力学,并用酪氨酸残基DPV信号的降低程度实现了caspase-3的检测。这种新方法简单方便,为细胞凋亡的无标记检测开创了一个新的思路。
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