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随着科学研究的发展,玉米肽越来越多的生物活性得到发掘,本课题组对玉米肽的醒酒、保肝活性进行过较系统地研究,然而,对于何种结构的玉米肽具有醒酒、保肝活性我们却知之甚少,对其发挥作用的分子机理、有效形式方面,尚有许多问题值得研究。本文针对本课题组前期从醒酒、保肝混合玉米肽中鉴定出的五肽QLLPF(Gln-Leu-Leu-Pro-Phe),采用Fmoc-固相合成法进行合成,并研究其醒酒活性,考察温度、pH等环境因素对其稳定性的影响;并从凋亡的角度研究其保肝作用分子机制;通过考察其I相代谢中的水解产物,详细研究了该重要五肽的代谢特征;以Nano-LC-ESI-MS/MS为手段,对玉米蛋白水解物中显著促乙醇代谢的级分进行了解析,并通过分子设计和Fmoc-固相合成研究了 QLLPF促进乙醇代谢的构效关系。主要研究结果如下:1玉米五肽QLLPF的醒酒活性与稳定性五肽QLLPF对于小鼠酒后体内乙醇的清除有着显著地作用,与具有血醇清除率为27.40%的混合肽(200 mg/kg bw)相比,当其剂量仅为混合肽剂量的1/20(10 mg/kgbw)时,却具有更高的血醇清除率(35.00%)。其体外稳定性试验结果显示,该五肽在温度低于70℃或pH4到10之间,含量均能保持在90%以上,表明该肽对温度和酸碱都有一定的耐受性;经胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶分别处理2 h后,依然能保持90%左右的含量,说明该五肽对胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的耐受性也较高。2玉米肽对酒精致肝细胞凋亡干预的分子机制以单次酒精刺激和多次酒精刺激的急性和亚急性小鼠为模型,从抑制肝细胞凋亡的角度,研究了混合玉米肽和重要五肽QLLPF的保肝活性。结果显示,该五肽和混合玉米肽均能显著逆转酒精引起的AST、ALT、MDA、GSH等生化指标的改变,且在亚急性模型中,五肽和混合肽的改善情况呈现出一定的量效关系。相对来说,混合肽(50 mg/kg bw 和 200 mg/kg bw)比五肽(10 mg/kg bw 和 30 mg/kg bw)的效果更佳。该五肽和混合玉米肽均能够上调乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的表达,表明玉米肽通过上调酒精代谢关键酶的表达,加速毒性物质的清除,这是其保肝机制之一。同时考察了与氧化应激相关的指标,尤其是线粒体中MnSOD的表达情况,五肽和混合玉米肽均能显著上调线粒体中MnSOD的表达,表明减轻氧化应激是其保肝机制之二。酒精引起肝细胞凋亡过程中路径调控的结果显示,玉米肽能够上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调促凋亡蛋白Bax的表达,抑制细胞色素C从线粒体的释放;下调细胞表面受体Fas与其配体FasL、重要的核因子NF-κB;抑制Caspase-3在基因和蛋白水平的表达。说明玉米肽通过参与内源性和外源性通路抑制肝细胞的凋亡,这是其具有保肝作用的重要机制。3五肽QLLPF的代谢特征对五肽Gln-Leu-Leu-Pro-Phe体外和体内的全血、肝脏和肾脏中主要I相代谢产物进行了研究。首先对样本制备过程中终止反应所需沉淀剂进行筛选,结果显示,在甲醇(含0.1%甲酸)中放置24h,该五肽的含量依然能保持在95%左右,即甲醇宜作为沉淀剂。对该五肽在全血、肝脏、肾脏组织匀浆液中体外温育产物的检测结果显示,其在肾脏中降解速度最快,肝脏次之,全血中最慢。且以全血中代谢产物最少,为 5 种:Leu-Pro、Pro-Phe、Leu-Pro-Phe、Gln-Leu-Leu-Pro、Leu-Leu-Pro-Phe;除这五种产物外,与全血样本相比,在肝脏匀浆液中检出另外一种肽段Leu-Leu-Pro;与全血样本相比,在肾脏匀浆液中检出另外两种肽段:Leu-Leu-Pro和Gln-Leu-Leu。采用直接灌胃(400mg/kgbw)SD大鼠的方法,追踪了该五肽在体内全血、肝脏和肾脏中主要代谢产物情况。结果显示,在全血中检出了 Gln-Leu-Leu-Pro-Phe,说明该五肽可以完整形式直接进入血液;此外检出Leu-Leu-Pro-Phe、Leu-Pro-Phe、Pro-Phe三种肽段。从肝脏和肾脏匀浆液中检出水解产生的代谢产物分别只有一种(Pro-Phe)和两种(Leu-Pro和Leu-Leu),其中Leu-Leu是所有体外样本和体内全血、肝脏样本中均未检出的肽段。说明肾脏和肝脏是该五肽的主要代谢场所;该五肽的半衰期很短,但Leu-Leu这一二肽应是其发挥生理活性的重要结构基础;Pro-Phe结构更能够抵抗体内蛋白酶的作用。4醒酒玉米肽的纯化、鉴定及以QLLPF为基础的构效关系为进一步明确具有醒酒活性的玉米肽的构效关系,我们对具有较好醒酒作用的玉米肽级分进行了超滤、半制备RP-HPLC纯化,并使用Nano LC-ESI-MS/MS对其中具显著醒酒作用的组分进行了鉴定,解析获得了 16条新肽段的一级结构。结果显示,疏水性较强的两组分F3-H4和F3-H5具有显著地清除血醇的效果;Ala、Leu、Pro和Phe在F3-H4和F3-H5两组分中是出现频率较高的氨基酸,暗示这4种氨基酸对玉米肽发挥醒酒作用可能具有重要的贡献。以Gln-Leu-Leu-Pro-Phe为基础,通过分子设计并合成一系列结构相关的短肽,采用急性醒酒模型评价其体内醒酒活性,结果显示,与母体肽段结构Gln-Leu-Leu-Pro-Phe相比,去掉Leu-Leu(即Gln-Pro-Phe)或是去掉Pro-Phe(即Gln-Leu-Leu)均使其促酒精代谢的能力严重受损或活性完全丧失。说明由相同氨基酸组成的Leu簇(Leu-Leu)和碳端的Pro-Phe结构单元发挥了重要作用。