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本文利用REMI技术构建突变株,筛选出具有防病、刺激植物吸收营养和修复环境等功能的菌株,旨在为创制多功能木霉菌制剂奠定理论和技术基础。取得了如下结果。
1.对康氏木霉菌T30进行了REMI转化,经过继代培养和抗潮霉素稳定性测定,共获得60个稳定的转化子。对转化子进行了特异性PCR扩增。结果显示,转化子均能扩增出特异性的潮霉素和氨苄青霉素基因,初步证明外源质粒转入到木霉菌T30的基因组内。同时对部分转化子进行了Southern分子杂交,不仅进一步证明外源质粒已整合到木霉菌。T30基因组,同时可以获得外源质粒的相对拷贝数的信息。
2.研究了绿色木霉菌T23及其转化子的生防机制。研究发现转化子之间生长速度的差异较大。筛选出四株对三种病原菌有较强的抑制作用的转化子H6、J6、K10、L2。在对镰刀菌抑制作用主要是通过快速生长占领生长空间和营养来源,试验中没有观察到覆盖镰刀菌的现象,因此,可以认为转化子对黄瓜及甜瓜尖孢镰刀菌不存在重寄生作用。而对茄丝核菌和莴苣菌核菌则表现为明显的重寄生作用,显微观察可以看到转化子对茄丝核菌和莴苣菌核菌的缠绕附着寄生生长的现象。
选择了3个转化子H6、J6、K10进行了黄瓜枯萎病的防治实验。试验结果表明,不同木霉菌转化子对黄瓜枯萎病防效明显不同。转化子H6、J6、K10对黄瓜枯萎病的防治效果优于野生菌株T23,分别为61.5%,60.5%和70.2%,而出发菌的相对防效为30.76%。
3.明确了T30及其转化子可降解有机磷农药敌敌畏。结果表明,转化子对有机磷农药敌敌畏都有一定的降解能力,其中TK-3的降解效率较高为98%。转化子降解有机磷农药效率与葡萄糖剂量、敌敌畏初始浓度、初始pH值关系密切。转化子降解敌敌畏的葡萄糖最佳浓度为100μg/ml,最适pH值为7.0,木霉菌能降解500μg/ml的敌敌畏,敌敌畏浓度过高则对木霉菌产生毒害而使其降解率下降。
4.比较分析了T30及其转化子间的解磷能力。研究表明,不同转化子对难溶性磷酸盐的溶解能力不同,其中,木霉菌T30的转化子TK-46对磷酸氢钙的溶磷能力最强,对磷酸氢钙的溶磷量达到363.7μg/ml,而出发菌T30为258.72μg/ml。复筛的三株转化子对磷酸氢钙的溶磷量都达到了350μg/ml以上,对磷酸铝的溶磷量也都达到了30μg/ml以上,对磷酸铁没有溶解能力。优势溶磷菌株TK-46溶解磷酸氢钙的最适碳源为蔗糖,最适氮源为氯化铵,溶解磷酸铝的最适碳源为麦芽糖,最适氮源为硫酸铵。几种碳源对转化子溶磷的影响较小,而几种氮源的影响却较大,转化子较易利用氨态氮,不易利用硝态氮。研究了pH值对转化子溶磷的影响。pH值变化与解磷机制关系有待于进一步研究。
5.在接种弯孢菌条件下,研究了木霉菌对玉米蛋白质组差异的影响。研究发现,木霉菌T23诱导根系可引起玉米叶片差异蛋白的变化。经过T23处理玉米根系,然后在叶片上接种弯孢菌,结果发现了两个特异表达的蛋白点,质谱鉴定为干旱诱导蛋白和醛酮变位酶Glyoxalase(Glx 1)。这一结果说明木霉可能具有系统诱导抗病相关蛋白表达的效应。
6.系统研究了木霉菌转化子发酵条件。最佳固体发酵培养基为麦麸:玉米渣(1:1),含水量为75%,添加腐殖酸钠5%,5L发酵罐中培养5d,该条件下产孢量可以达到10<11>个/g。转化子菌剂对黄瓜枯萎病和猝倒病的防效在60%以上,而且转化子对黄瓜和玉米生长有明显的促进作用。